[发明专利]猪圆环病毒2型灭活疫苗

说明书

一.技术领域

本发明猪圆环病毒2型灭活疫苗属于生物技术高科技领域，专用于加强猪对PCV2免疫保护作用及减少猪场的经济损失。

二、技术背景

PCV-2是世界范围内的一种猪病，给世界的养猪业造成了巨大的损失。该病毒主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合症和肾病皮炎综合症。同时该病在一定程度上还会造成免疫抑制，容易造成其它疾病的继发或并发感染，尤其是该病与PRRS有相互协同作用。由于该病毒是一种DNA病毒，病毒的变异率低，同时在世界范围内的致病只有PCV2一型。同时该病毒自身有很好的抗原性，能够诱导机体产生高水平的抗体和对该病提供保护作用。但是该病毒分离困难、鉴定困难、培养困难，因此在我国目前还没有一个有效的防治该病的疫苗上市。有鉴于此，我实验室投入了大量的人力、物力对该病毒进行分离、鉴定等工作。并对获得的分离株SH株经大规模培养后制备了灭活疫苗进行免疫实验，证明效果良好。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是研制一种能够有效控制猪圆环病毒病的疫苗，使我国当前发生的PCV2病得到有效的控制，从而可以减少猪场的损失和提高经济效益。

技术方案  本发明的实施方案如下：

猪圆环病毒2型(PCV2)，其特征在于，猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属。这科病毒有鸡贫血病毒、鹦鹉喙羽病病毒。猪圆环病毒2型是动物病毒中最小的一员。病毒粒子的直径14～25nm，二十面体对称，无囊膜，基因组为单股DNA。猪圆环病毒2型(SH)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2389。

上述猪圆环病毒2型(PCV2)SH毒株，是通过以下获得的：

(1)病毒的分离和培养2002年从上海地区发生严重的断奶仔猪多系统衰竭综合症的猪场采集病料，病料经匀浆、反复冻融3次后，高速离心后经0.22um滤膜过滤后接种于长满单层的PK-15细胞。对接种病料的PK-15细胞进行连续传代进行病毒分离。

(2)猪圆环病毒2型阳性分离株的鉴定将PK-15细胞连续传代6代后，取其中的部分细胞经冻融后提取PCV-2病毒的DNA，用针对PCV-2病毒Cap蛋白基因的特异性PCR引物对目的基因扩增。扩增产物克隆入pMD-18T载体进行测序。

(3)PCV2-SH分离株的纯化鉴定好PCV2分离株经有限稀释法进行病毒纯化，工进行3次病毒纯化，获得了纯化的PCV2病毒的上海分离株(SH)。

上述猪圆环病毒2型(PCV2)SH毒株制备疫苗的方法为：

将PCV2-SH株在PK-15细胞中大量增殖，经甲醛灭活加入白油佐剂进行乳化，制备常规的白油佐剂疫苗。在扩大病毒培养过程中取用低温保存的PCV2(SH)按10⁴TCID₅₀接种长成单层的PK-15细胞。接种24小时后，弃去维持液，用D-氨基葡萄糖进行孵育，然后弃去D-氨基葡萄糖加入维持液，3天后收毒。

用上述猪圆环病毒2型SH毒株制成的疫苗：

将纯化的PCV2病毒在PK-15细胞上连续传代50次，每5代通过IPMA法测定病毒的效价。证明该病毒在PK-15细胞中连续传代表现稳定，接毒后细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在10^4.33TCID₅₀/1.0ml。

有益效果

本发明首次提出了用PCV2分离毒株制备针对PCV2的灭活疫苗，该疫苗的研究和制备解决了我国当前对该病无法进行预防的缺陷，可以有效的解决当前PCV2发病率高，造成损失大的影响。用分离株制备的灭活疫苗工艺简单、操作方便，而且制备出的疫苗抗原性好，安全性高，对外界环境无任何不良影响，容易通过安全评价。

试验证明，本发明制备的PCV2-SH株灭活疫苗对动物不产生任何不良反应，试验安全性高，而且对免疫动物能够诱导产生高水平的循环抗体和中和抗体，ELISA抗体效价达到，中和抗体效价达到，免疫后的动物能够有效的抵抗PCV2病毒的攻击。

针对我国目前PCV2发病率比较高，该疫苗的制备、生产、应用和普及将为防止我国的PCV2疾病的发生和流行提供有力的工具。

四、附图说明

图1.病毒增殖曲线

五、具体实施方式：

1、毒种来源及标准

制造本品用和检验的毒种为PCV2-SH毒株，由南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室在2002年从上海某猪场分离鉴定而来，命名为ShangHai分离株(简称SH株)。

1.1毒种标准