[发明专利]对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因育种领域，具体涉及一种生产对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕的方法。

背景技术

家蚕血液型脓病是蚕业生产中经常发生的一种传染性蚕病，是蚕茧产量歉收的重要原因之一，该病是由家蚕核型多角体病毒(Bombyx moriNucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染引起的。上个世纪，在养蚕生产中，人们综合应用遗传学、生理学、病理学、生态学等方面的研究成果，通过彻底消毒，消灭传染源，加强饲养管理，提高蚕体对病毒的抵抗性以及饲养抗病性品种等方面的措施，对家蚕血液型脓病进行综合防治，取得了明显的效果。然而在大型养蚕场中采取这些措施不仅需要大量人力物力，还会使养蚕场设备复杂化。

因此，培育抗血液型脓病的家蚕品种是防治传染性蚕病传染与发生的关键措施，国内外已有许多研究人员在家蚕抗病品种选育方面做了很多有益的探索和研究，一般认为，家蚕对家蚕核型多角体病毒的抗性属水平抗性，通过常规方法进行抗家蚕核型多角体病毒品种选育定向性差、周期长、育种效率低。因此，有必要探索提高家蚕品种对家蚕核型多角体病毒抵抗性的新方法。

家蚕核型多角体病毒属杆状病毒科的成员，病毒基因组为130kb左右的环状双链DNA，已有多个杆状病毒的基因组全序列被测定，对大多数基因的功能已作了较为详细的研究。研究结果表明，杆状病毒DNA在感染细胞的核中进行复制所必需的基因包括：编码病毒基因表达和DNA复制的必需蛋白IE-1(Pathakamuri JA，Theilmann DA.The acidic activation domain of thebaculovirus transactivator IE1 contains a virus-specific domain essential forDNA replication.JVirol，2002，76：5598-5604)、LEF-1(一种DNA引发酶)(Mikhailov VS，Rohrmann GF.Baculovirus replication factor LEF-1 is aDNA primase.J Virol，2002，76：2287-2297)、LEF-2(与LEF-1相互作用蛋白)、LEF-3(单链DNA结合蛋白)、dnapol(DNA聚合酶)和p143(dnahel，DNA解链酶)等。基因敲除研究表明，缺失这些基因，病毒将不能增殖复制，因此，抑制这些必需基因的功能性表达可能是防止家蚕感染家蚕核型多角体病毒的一种有效策略。

而RNAi技术的发展使之成为可能，RNAi(RNA interference)是一种依赖于双链RNA(dsRNA)抑制其互补同源基因活性的现象。RNAi介导的基因沉默是抑制病毒复制的一种强有力手段，通过化学合成、体外转录制备的小分子抑制RNA(short interfering RNAs，siRNAs)以及通过RNA表达载体在细胞中转录产生的小分子抑制RNA已成功地抑制了多种病毒的增殖复制(Lopez T，Camacho M，Zayas M，Najera R，Sanchez R，Arias CF，Lopez S.Silencing themorphogenesis of rotavirus.J Virol.2005，79(1)：184-92；Su san L.Uprichard，Bryan Boyd，Alana Althage and Francis V.Chisari.Clearance of hepatitis Bvirus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs.PNAS，2005，102(3)：773-778)，因此，可以认为RNAi技术为抑制家蚕核型多角体病毒在家蚕体内增殖复制、提高家蚕对家蚕核型多角体病毒的抵抗性提供了可能。