[发明专利]对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法无效
| 申请号： | 200810024110.6 | 申请日： | 2008-04-30 |
| 公开（公告）号： | CN101270365A | 公开（公告）日： | 2008-09-24 |
| 发明（设计）人： | 贡成良;薛仁宇;曹广力;沈卫德 | 申请（专利权）人： | 苏州大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/11;A01K67/04 |
| 代理公司： | 苏州创元专利商标事务所有限公司 | 代理人： | 陶海锋 |
| 地址： | 215123江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 血液 型脓病 具有 抗性 转基因 家蚕 制作方法 | ||
1.一种对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法，其特征在于包括如下步骤：
[1]构建用家蚕组织有活性的启动子控制家蚕核型多角体病毒的ie-1基因的dsRNA表达盒和lef-1基因的dsRNA表达盒；
[2]将步骤[1]获得的两种表达盒克隆进以转座子piggyBAC因子为基础的带有荧光蛋白报告基因的转基因载体，获得转基因载体pigRNAi-ie-lef；
[3]用家蚕组织有活性的启动子控制新霉素抗性基因，克隆进步骤[2]转基因载体pigRNAi-ie-lef获pigRNAineo-ie-lef；
[4]将转基因载体pigRNAineo-ie-lef与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕用G418筛选至4龄眠，结合荧光蛋白报告基因筛选，获得抗G418、带有荧光蛋白报告基因的转基因家蚕，进一步将转基因家蚕的杂交后代，接种家蚕核型多角体病毒，通过验证筛选获得对血液型脓病有抗性的转基因家蚕。
2.根据权利要求1所述的对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法，其特征在于：所述步骤[1]中，构建家蚕核型多角体病毒的ie-1基因的dsRNA表达盒和lef-1基因的dsRNA表达盒时，根据已公开的家蚕核型多角体病毒的全基因组序列，GenBank上的登录号为L33180，选择ie-1基因编码区内长度为19-23nt DNA序列作为RNAi的dsRNA设计的靶序列，构建BmNPV的ie-1基因的dsRNA表达盒，选择lef-1基因编码区内长度为19-23ntDNA序列作为RNAi的dsRNA设计的靶序列，构建BmNPV的lef-1基因的dsRNA表达盒；其中，以ie-1基因的起始密码ATG的A定位为1，则ie-1基因编码区内的dsRNA设计的靶序列的起始位点分别为第202、415、657、887、1097、1099、1127、1128、1162、1163、1329、1408、1481、1622、1623、1624、1681、1682、1696、1697位点，选择长度为19-23nt DNA序列作为RNAi的dsRNA设计的靶序列，构建BmNPV的ie-1基因的dsRNA表达盒；以lef-1基因的起始密码ATG的A定位为1，则lef-1基因编码区内的dsRNA设计的靶序列的起始位点分别为第57、134、135、222、225、226、349、419、506、507、513、518、533、611、612、616、716、778、779，选择长度为19-23ntDNA序列作为RNAi的dsRNA设计的靶序列，构建BmNPV的lef-1基因的dsRNA表达盒。
3、根据权利要求1所述的对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法，其特征在于：步骤[3]中，所述的pigRNAineo-ie-lef通过先将家蚕组织有活性的启动子控制的新霉素抗性基因neo表达盒克隆进以转座子piggyBAC因子为基础的带有荧光蛋白报告基因的转基因载体，然后再克隆进ie-1基因的dsRNA表达盒和lef-1基因的dsRNA表达盒获得；
4、根据权利要求1所述的对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法，其特征在于：步骤[3]中，所述的pigRNAineo-ie-lef通过将步骤[1]获得的表达盒克隆进以转座子piggyBAC因子为基础的带有荧光蛋白报告基因的转基因载体，获得转基因载体pigRNAi-ie-lef，再将用家蚕组织有活性的启动子控制新霉素抗性基因neo表达盒克隆进转基因载体pigRNAi-ie-lef而获得。
5、根据权利要求1所述的对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法，其特征在于：步骤[4]中，孵化后的蚁蚕用10000μg/mL的G418筛选至4龄眠，结合荧光蛋白报告基因筛选，获得抗G418、带有荧光蛋白报告基因的转基因家蚕，进一步将转基因家蚕的杂交后代，接种家蚕核型多角体病毒，通过验证筛选获得对血液型脓病有抗性的转基因家蚕。
6.一种对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法，其特征在于包括如下步骤：
[1]构建用家蚕组织有活性的启动子控制家蚕核型多角体病毒的ie-1基因的dsRNA表达盒和lef-1基因的dsRNA表达盒；
[2]用家蚕组织有活性的启动子控制新霉素抗性基因，克隆进以转座子piggyBAC因子为基础的带有荧光蛋白报告基因的转基因载体，获得转基因载体pigRNAineo；
[3]将步骤[1]获得的两种表达盒克隆进步骤[2]得到的转基因载体pigRNAineo获得pigRNAineo-ie-lef；
[4]将转基因载体pigRNAineo-ie-lef与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕用G418筛选至4龄眠，结合荧光蛋白报告基因筛选，获得抗G418、带有荧光蛋白报告基因的转基因家蚕，进一步将转基因家蚕的杂交后代，接种家蚕核型多角体病毒，通过验证筛选获得对血液型脓病有抗性的转基因家蚕。
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