[发明专利]一种含CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的筛选及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的筛选以及该啤酒酵母菌在生产胞苷三磷酸中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

胞苷三磷酸(简称：CTP)是机体细胞内的一种正常成分，它在体内参与核酸和磷脂类的合成代谢，促进蛋白质的合成，并提供能量，还可以调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，能够对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤，从而起到抗血管硬化的作用。而胞苷一磷酸激酶(CMP kinase)和胞苷二磷酸激酶(CDP kinase)的主要作用是负责激活胞苷三磷酸合成酶(CTP synthetase)，激活胞苷三磷酸合成酶能降低胞苷一磷酸(简称：CMP)水平，使CMP合成CTP。目前已有厂家生产CTP注射液制剂，临床上主要用于治疗多种原因引起的神经系统及心血管类疾病，如脑血管意外及其后遗症；脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍；神经官能症；脑血管硬化、老年性痴呆；外周神经损伤；儿童脑发育不全等。(Ishige Kazuya，2002)枯草芽孢杆菌jofC编码CMP激酶，啤酒酵母中URA6编码CMP激酶(Shinya Kaneko，1998)。大肠杆菌中mssA基因编码CMP激酶已被Fricke等人证实，虽然CMP激酶不是大肠杆菌所必需，但CMP激酶在ATP提供磷酰基情况下，可逆催化CMP转化CDP，进而生成CTP：

ATP·Mg²⁺+CMP→ADP·Mg²⁺+CDP

ATP·Mg²⁺+CDP→ADP·Mg²⁺+CTP

CTP的合成工艺方法主要包括化学法、生物合成法、光合磷酸法等。由于底物价格的原因，国内外对CTP工业化生产的研究甚少，在我国真正生产CTP的企业基本上没有，但自发现可作为药物以后，市场需求逐年增大，随着CMP价格的逐年下降，生产前景十分看好。CTP在上世纪80年代国内的生产方法主要都是通过分离出酵母体内的自身酶系对CM P进行转化，生产工艺比较成熟，但该工艺不能完全分离出糖酵解系统中的所有酶，酶失活率高，转化率低，(Ethan SSimon，1990)。应国清等人(2004)利用游离的啤酒酵母将CMP合成为CTP，CTP的转化率可维持在80％左右，詹谷字等人(1997)用菠菜叶绿体通过光合磷酸化反应将CMP合成为CTP，转化率为85％。

发明内容

本发明的目的是公开一种含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌。

本发明的另一个目的是提供筛选该啤酒酵母菌的方法。

本发明的再一个目的是公开该啤酒酵母菌在生产胞苷三磷酸中的应用。

本发明通过以下技术方案达到以上目的：一种含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株，菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，其在2008年4月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号是：CGMCC NO.2448。

所述菌株的筛选方法的步骤包括：

(1)制作酵母菌悬液，将酵母经培养基活化后放入摇床振荡培养到细胞处于对数生长期后离心回收菌体，加入磷酸盐缓冲液制成菌悬液；

(2)将上述菌悬液与诱变剂按1∶1容量比混合，30℃恒温水浴10-50分钟后，混合液稀释至10^-3倍-10^-6后涂布平板，得到抗性菌株；

(3)将上述抗性菌株经摇床培养24-36小时，用高效液相色谱法检测并筛选出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌株；其中，摇床的温度为26-36℃，转速为160-300rpm，所述步骤(2)中的诱变剂是2mg/ml的亚硝基胍；所述平板中的培养基含有300μg/ml胞苷三磷酸结构类似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌株为胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突变株。

本发明的啤酒酵母菌菌株在生产胞苷三磷酸中的应用包括：利用包埋法以卡拉胶-魔芋多糖复配胶为载体将所述菌种制成固定化细胞后加入合成胞苷三磷酸的反应体系中，再利用离子交换分离纯化的方法分离纯化反应液，最后结晶得到胞苷三磷酸。其具体步骤是：

(1)将卡拉胶钠盐和魔芋粉溶于去离子水中，蒸汽加热到121℃后保温40～70分钟，倒入反应釜中自然冷却到40℃，胶液保温，其中k-卡拉胶钠盐与魔芋粉的重量比为2∶1；

(2)将生理盐水加入洗涤好的啤酒酵母湿菌体中搅拌均匀制成酵母悬液，35℃保温，其中生理盐水和啤酒酵母湿菌体的重量比为1∶4；