[发明专利]一种3－甲基－喹啉－2－羧酸的免疫荧光猝灭检测方法

说明书

技术领域

一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，属于免疫分析化学技术 领域。

背景技术

3-甲基-喹啉-2-羧酸，英文名称：3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA)，是喹啉类饲料添加剂在动物体内的代谢产物，以喹诺酮和喹乙醇为 主要代表。当鸡、猪、鱼等食用此类饲料添加剂后，会在体内，主要是肌肉， 肠道，肾脏中代谢生成3-甲基-喹啉-2-羧酸，这种代谢物对人体毒性极大。由于 国内对喹啉类添加剂的大量滥用，造成了添加剂在动物体内的含量严重超标， 国内的检测技术尚停留在对原药的检测，随着国际标准的提高，我国贸易的国 际化，这种检测技术已经不能满足要求。近年来，国外开始逐渐加大了对代谢 物3-甲基-喹啉-2-羧酸的研究和检测。为了与国际接轨，减少我国的肉类制品在 出口时不必要的损失，我国有必要加大对代谢物的研究力度，由于对其研究较 少，检测限仍然较高，为了弥补这一空白，有必要研究一种灵敏度高，检测限 低，操作简单的，针对3-甲基-喹啉-2-羧酸的检测方法。

HPLC和LC-MS/MS的方法虽然灵敏，但是所需仪器价格昂贵，对操作人 员的要求较高，较难推广。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单， 专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本发明利用纳米磁性粒子作为固 相载体，在流动注射系统中进行免疫反应，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针， 免疫反应后，收集DNA，并将其固定于金纳米粒子表面，加入异硫氰酸荧光素， 检测荧光信号从而达到检测3-甲基-喹啉-2-羧酸的目的，本发明方法大大提高了 检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为 固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子 作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵 敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，灵 敏度高，操作方便，线性范围宽。

本发明的技术方案：一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，包 括免疫源、包被原、和抗体的制备，包被原的固定，磁性纳米粒子的修饰，磁 性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，流动注 射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；工艺步 骤为：

(1)包被原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清 蛋白相偶联得到包被原；

(2)免疫原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；

(3)抗体的制备：用所得免疫原免疫兔子得到特异性多克隆抗体；

(4)包被原的固定：用所得包被原与磁性微粒偶联，并固定于玻璃微通道内；

(5)磁性纳米粒子的修饰；将制备的Fe₃O₄种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；

(6)磁性纳米粒子与包被原的偶联；

(7)两种粒径的金纳米粒子的制备；

(8)两种金纳米探针的制备；

(9)流动注射系统中的免疫反应；

(10)荧光酶标板的包被；

(11)流动注射荧光猝灭的检测：利用间接竞争免疫检测将3-甲基-喹啉-2-羧 酸和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体 及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集 得到的单链DNA一端与互补DNA修饰的金纳米探针反应，另一端与生物素修饰 的互补DNA反应，并用亲和素固定于酶标板上，加入异硫氰酸荧光素，用荧光 酶标仪检测荧光信号从而检测3-甲基-喹啉-2-羧酸含量。