[发明专利]一种3－甲基－喹啉－2－羧酸的免疫荧光猝灭检测方法

权利要求书

1.一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是包括免疫源、 包被原、和抗体的制备，包被原的固定，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子 与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，流动注射系统中的 免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；工艺步骤为：

(1)包被原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清 蛋白相偶联得到包被原；

(2)免疫原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；

(3)抗体的制备：用所得免疫原免疫兔子得到特异性多克隆抗体；

(4)包被原的固定：用所得包被原与磁性微粒偶联，并固定于玻璃微通道内；

(5)磁性纳米粒子的修饰：将制备的Fe₃O₄种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；

(6)磁性纳米粒子与包被原的偶联；

(7)两种粒径的金纳米粒子的制备：所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清 洗，晾干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯 金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液3.5mL或1mL，边加热边搅 拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降， 最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏；加入3.5mL柠檬酸三钠 溶液制得的金纳米粒子平均粒径为13nm，加入1mL柠檬酸三钠溶液制得的金纳 米粒子平均粒径为30nm；

(8)两种金纳米探针的制备：

30nm金纳米探针的制备：首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在pH9.1 碱性水溶液中搅拌反应，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸5’- TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGt(10 )-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH 值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用 含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，加入1.5μM的寡核苷酸5’- CGCATTCAGGATTGCATGAATGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3’37 ℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于含0.3M NaCl 的10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金纳 米探针，作为储备液4℃保藏；

13nm金纳米探针的制备：直接向13nm金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸

5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室温反应20小时， 再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4 ℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐 缓冲液溶解，4℃保藏；

(9)流动注射系统中的免疫反应；先用pH 7.0、含0.1M NaCl的0.01M磷酸 盐缓冲液作洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL 0.5mg/mL抗原修饰的超顺 磁纳米粒子溶液吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通 电，吸附磁珠，将其固定在反应池内；将预孵育的50μL抗体和50μL 3-甲基-喹啉 -2-羧酸混合溶液吸入螺线管中，其中，3-甲基-喹啉-2-羧酸溶解于pH7.4、含0.05％ Tween-20的0.01M PBST中，浓度从1pg/mL～100pg/mL；然后，将混合溶液注入 免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL pH7.0、0.1MNaCl 的0.01M PBS洗液；之后，将100μL的羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金 纳米探针的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗；以2μL/s的速度 注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单 链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用；

(10)荧光酶标板的包被；用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入 100μL亲和素的pH9.6碳酸钠缓冲溶液，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用；

(11)流动注射荧光猝灭的检测：利用间接竞争免疫检测将3-甲基-喹啉-2-羧 酸和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体 及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集 得到的单链DNA一端与互补DNA修饰的金纳米探针反应，另一端与生物素修饰 的互补DNA反应，并用亲和素固定于酶标板上，加入异硫氰酸荧光素，用荧光 酶标仪检测荧光信号从而检测3-甲基-喹啉-2-羧酸含量；

将收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针25μM，5’-生物素 -a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’混合，再加入20μL的含0.3M NaCl、0.02％SDS的pH7.40.01M PBS溶液，37℃孵育10分钟后，再加入20nM 13nm金纳米探针进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光酶 标板上，室温孵育30分钟，最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL异 硫氰酸荧光素，震荡，荧光检测，荧光强度通过Wallac1420工作站在线观测。