[发明专利]一种新型巯基荧光探针及其应用

说明书

一技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及活细胞或生物活体中巯基含量的测定技术，是一种可用于活细胞中巯基成像测定的荧光探针及其应用。

二背景技术

巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团。在蛋白质中，巯基部分是与酶活性有关的最具有反应性的官能团。细胞中的巯基，尤其是谷胱甘肽(GSH)作为细胞内的亲核和还原试剂，能保护细胞不受缺氧、毒素、诱变、放射线及许多致癌物的侵害。随着巯基官能团在生物体系中的重要作用逐渐被认识，鉴别和定量测定生物巯基化合物的方法日益受到关注。传统的检测方法有硝普盐法、碘量法、电流分析法、分光光度法、比色法等，但这些方法灵敏度低(毫摩尔级以上才能检测)，不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定，因此需要合成一些高灵敏度的分析检测试剂。

荧光测定法由于其成本低，可重复性好，测定灵敏，选择性高，并且能够实现可视化观测，是一种非常好的测定手段。因此，新型的巯基荧光检测试剂成为研究的焦点。巯基荧光探针灵敏度高，可作为生物结构研究指示系统，因而被广泛应用到研究蛋白质结构和微环境性质、微量检测胆碱酶或谷胱甘肽S-转移酶、组织化学染色、抗原-抗体反应的检测和定位、疾病的诊断、HPLC分析巯基化合物等领域。

已报导的巯基荧光探针有芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类等，它们具有好的选择性和灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔(nmol)左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活细胞成像时会造成较低的信噪比；还有一类如苯并呋喃磺酰卤，虽然其自身荧光较弱，但需要在碱性条件及高于室温下与巯基衍生，也无法应用于活细胞成像。最常用来衍生巯基的试剂是乙酰卤衍生物，主要是碘乙酰胺衍生物，它和巯基反应快，在室温和生理pH下即可进行，但产物容易失去荧光团，并且自身对光不稳定。这些现存的巯基荧光探针均不能很好地满足生物荧光检测和荧光成像的要求。

马来酰亚胺类荧光化合物与巯基可发生稳定的加成，且自身荧光较弱，在与巯基加成后荧光增强，这种仅在反应后得到荧光增强的特点使其表现出独有的优越性，但一般的荧光团和马来酰亚胺结合后，量子产率较低，荧光寿命短，并且Stokes位移较小，较难进行高质量的细胞内荧光成像。2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物属于激发态质子转移型高性能荧光团，其量子产率高，荧光寿命长，并有着较大的Stokes位移，可以减少系统中背景荧光的干扰，并且细胞毒性小，非常适用于作为活细胞应用的荧光团(Jie Ouyang et al.Journal of Heterocyclicchemistry，41，359-365(2004))，因此，以马来酰亚胺类基团修饰的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物，有希望作为一种新型的活细胞巯基荧光探针得到应用。

三发明内容

本发明需要解决的问题是：

1.提供一种基于马来酰亚胺/马来酰亚胺酸和2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物的，可用于活细胞检测的高性能活性巯基荧光探针。这种荧光探针可以为研究活细胞中一些重要的蛋白酶类和酶学过程中的机制，阐明生物系统中某些重要信号通路，某些重大疾病(如癌症、免疫失调等)的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；

2.提供该荧光探针的应用途径。

本发明的技术方案为：

1.活性巯基荧光探针的结构及其合成方法

本发明的荧光探针结构式为：

该荧光探针的合成方法可参照如下步骤：

a.芳胺重氮盐的制备：苯胺溶于水中，加入浓盐酸，使苯胺变成盐酸盐完全溶解，冰浴冷却。亚硝酸钠溶于少量水，冰冷却，搅拌下慢慢加入到上述溶液中；

b.5-偶氮苯基水杨醛的制备：NaOH溶于水中，加入到水杨醛中，变成水杨醛钠盐溶解于水中，搅拌，保持在0℃。搅拌下将重氮盐溶液缓慢加入，同时滴加Na₂CO₃溶液保持pH为8左右。生成的沉淀用乙酸乙酯和正己烷(1∶1)重结晶即可得；

c.偶氮苯基苯并咪唑的制备：将等摩尔5-偶氮苯基水杨醛，亚硫酸氢钠与无水乙醇混合后常温搅拌，然后将等摩尔邻苯二胺溶解在DMF中，滴加到前面的溶液中加热回流。反应完毕将反应物倒入冷水，析出沉淀，抽滤，干燥，丙酮重结晶两次；

d.2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑的制备：将偶氮苯基苯并咪唑，80％水合肼，5％Pd/C催化剂，无水乙醇混合，迅速升温至回流反应，热过滤，滤液浓缩至有晶体析出，抽滤，冷乙醇洗涤，乙醇重结晶；