[发明专利]一种新型巯基荧光探针及其应用

权利要求书

1.一种测定活性巯基的荧光探针，其特征在于该荧光探针是马来酰亚胺或马来酰亚胺酸修饰的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物，其结构式为：

2.根据权利要求1所述测定活性巯基荧光探针的合成方法，其特征是：

(1)芳胺重氮盐的制备：称取3～6g苯胺加入到40mL水中，再加入15mL浓盐酸，使苯胺变成盐酸盐完全溶解，冰浴冷却至0℃。称取2.3～5g亚硝酸钠溶解在少量水中配成溶液，冰冷却，搅拌下慢慢加入到上述溶液中，即可制得氯化重氮苯溶液。用碘化钾试纸测试是否变蓝色，如变蓝色说明溶液中含有过量的亚硝酸，可用尿素中和，直到碘化钾试纸不变色；

(2)5-偶氮苯基水杨醛的制备：称取2～4g NaOH溶解于300mL水中，加入到盛有5～10g水杨醛的三口瓶中，变成水杨醛钠盐溶解于水中，将此溶液在搅拌条件下保持在0℃。搅拌下将重氮盐溶液缓慢滴加到已制备好的水杨醛钠盐溶液中，同时滴加Na₂CO₃溶液使反应液在pH＝8附近。反应过程有大量金黄色沉淀析出。滴加完毕，静置，抽滤，真空干燥，得粗品，用乙酸乙酯和正己烷(1∶1)重结晶，产物m.p.126～129℃；

(3)偶氮苯基苯并咪唑的制备：将等摩尔(2～10mmol)5-偶氮苯基水杨醛，亚硫酸氢钠与25mL无水乙醇混合后常温搅拌，然后将等摩尔邻苯二胺溶解在25mL DMF中，滴加到前面的溶液中加热回流1.5～3h。反应完毕将反应物倒入10倍冷水中，析出沉淀，抽滤，干燥，丙酮重结晶两次；

(4)2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑的制备：将3～8g偶氮苯基苯并咪唑，9～20mL 80％水合肼，适量5％Pd/C催化剂，131mL无水乙醇混合，迅速升温至回流反应50min，热过滤，滤液浓缩至有晶体析出，抽滤，冷乙醇洗涤，乙醇重结晶；

(5)探针2的合成：在三口瓶内加入0.1～0.4g马来酸酐，用5mL丙酮溶解，室温下分批搅拌加入0.2～1g 2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑固体，出现黄色沉淀，加料完毕室温搅拌反应1.5h。抽滤，丙酮洗涤，干燥，得到探针2粗品，粗品用稀盐酸处理，得到黄色固体粉末；

(6)探针1的合成：在装有0.5～1.5g探针2的三口瓶内，加入10mL甲苯，0.5mL DMF以及适量对甲苯磺酸，加热回流反应6h，然后加入适量DMF至固体完全溶解，继续加热回流反应一天，反应过程用TLC监控(乙酸乙酯作展开剂)。反应完毕蒸出甲苯，剩余褐色液体倒入冷水中，析出褐色沉淀，经抽滤，水洗，干燥，得到探针1粗品，用柱层析硅胶分离，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1作展开剂，得到探针1纯品，合成路线如下：

3.根据权利要求1所述测定活性巯基荧光探针在生物工程工业中的应用。

4.根据权利要求1所述测定活性巯基荧光探针在化学体系巯基检测中的应用。

5.根据权利要求1所述测定活性巯基荧光探针在生物活细胞内的巯基分析检测和荧光成像检测中的应用。