[发明专利]重组猪α型干扰素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组猪α型干扰素(interferon，IFN)的研制方法及过程。系将带有猪α型IFN基因重组质粒转化大肠杆菌，并使其高效表达猪α型IFN，经纯化后加入适量猪血浆白蛋白稳定剂冻干制成，用于治疗猪病毒性腹泻和流行性感冒等病毒性疾病。研制及检定的标准均采用国家SFDA认证的重组人α型IFN(中国生物制品规程中国生物制品标准化委员会编2000版)作为参比并实施。

背景技术

猪病毒性疾病是当前严重制约猪养殖业健康发展的主要传染病。全年均有发生，如猪病毒性腹泻、流行性感冒等。这些动物一旦感染发病，则有起病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，猪与人类密切接触，某些动物病毒性传染病还给人类健康带来潜在威胁。目前对猪病毒性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素。但由于养殖环境不完善，病毒变异以及机体抵抗力变化等原因，使传统的预防和治疗途径受到了巨大挑战，大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给人类健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒的不断出现给猪养殖业带来的巨大危害。因此，积极治疗家禽、家畜病毒病将是人类最为关注的问题。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三类。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞 内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。猪IFN是一类能诱导猪细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，主要用于猪流行性腹泻和猪流行性感冒等病毒性疾病的防治，特别是和猪用其它细胞因子协同使用时，效果更佳。因此，IFN是当今应用前景广阔的重要生物制剂之一。

目前，国内最早应用于兽医临床的是猪白细胞IFN，但采用血细胞分离的方法获得的白细胞IFN成本较高，血源易被污染，很难进行工业化生产。而采用基因工程技术生产重组猪α型IFN除可避免上述弊端外，尚有纯度高，成本低，可规模化生产等优势，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪α型干扰素的制备方法，是将猪α型IFN基因重组质粒转化大肠杆菌，使其高效表达猪α型IFN，经纯化后除菌、分装和冻干等工艺制成，是一种广谱抗病毒制剂，主治猪病毒性腹泻和流行性感冒等病毒性疾病。

本发明技术方案如下：

重组猪α型干扰素的制备方法，其特征是进行以下步骤：

(1)、构建克隆载体

目的基因为：

TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGC A TGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTG AA GAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAG TCC CTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGG

特异性引物：上游：GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA

下游：CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC

克隆载体：pMD18-T simple vector

(2)、构建表达载体

表达载体：pET-28a，或者pGEX-5X