[发明专利]重组猪α型干扰素的制备方法

权利要求书

1.重组猪α型干扰素的制备方法，其特征是进行以下步骤：

(1)、构建克隆载体

目的基因为：

TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA

特异性引物：上游：GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA

            下游：CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC

克隆载体：pMD18-T simple vector

(2)、构建表达载体

表达载体：pET-28a，或者pGEX-5X

(3)、重组蛋白的表达

挑取载体构建成功的重组表达菌进行扩增、放大培养，并加入诱导剂低温诱导表达；

(4)、鉴定重组蛋白

应用抗α型干扰素参考血清做中和实验，证明型别无误；

(5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。

2.根据权利要求1所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于具体步骤为：

(1)、构建克隆载体

目的基因：

TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA

特异性引物序列：上游：GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA

                下游：CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC

用特异性引物PCR扩增猪α型干扰素的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定，根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；

(2)、构建表达载体

鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-28a或者pGEX-5X进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别进行培养，鉴定出表达载体构建成功的重组表达菌；

(3)、重组蛋白的表达

分别挑取与pET-28a或者pGEX-5X表达载体连接的重组表达菌进行小量扩增、放大培养，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，低温诱导表达，收集细菌；

(4)、鉴定重组蛋白

应用抗α型干扰素参考血清做中和实验，证明型别无误；

(5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。