[发明专利]一种分离纯化糖肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离纯化糖肽的方法，尤其涉及一种用磁性微粒分离纯化糖肽的方 法。

背景技术

蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动 物中一半以上的蛋白质是发生糖基化的。糖基化对蛋白质的结构和功能起着重要的作用， 蛋白质糖基化的程度及糖链结构的异常变化常常是癌症及其他疾病发生的标志。

蛋白质糖基化程度和糖基化位点的变化可通过糖基化多肽(糖肽)的变化检测出来。 近几年，分离纯化复杂样品中糖肽的方法主要有凝集素法和肼化学法。复杂样品如血清 以及细胞膜总蛋白等。

凝集素法是先用凝集素提取分离纯化样品中的糖蛋白，结合双向电泳分离，再酶解 或直接酶解后再次用凝集素提取糖肽，之后质谱鉴定。该方法的主要缺点是：凝集素本 身的特异性结合特性会造成样品分离纯化的选择性，不同的凝集素具有结合不同类型糖 蛋白的特生，因而单一凝集素不能一次提取分离纯化样品中的全部糖蛋白，且双向电泳 工作费时、费力。

肼化学法是用肼化学分离纯化提取糖蛋白，可一次性不选择地分离纯化几乎所有类 型的糖蛋白/糖肽，然后用不同的方法依次洗脱。比如：用糖肽酶(PNGase F)释放N- 糖蛋白/糖肽，β-消除法释放O-糖蛋白/糖肽，但该方法的主要缺点是：目前肼化学分 离纯化糖肽时一般使用的固体载体是肼凝胶柱，分离速度缓慢，费时、费力，有些甚至 还需要离心机等分离设备，其次，肼凝胶柱的比表面积较小，所以糖蛋白分子的吸附容 量就较小，样品接触反应的机会较小，增大了糖蛋白与肼凝胶柱的偶联时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化糖肽的方法，，其解决了背景技术中肼化学方法 分离纯化糖肽程序复杂，分离纯化反应时间长的技术问题。

磁性微粒简称磁粒，作为一种新的生物分子分离纯化的载体，较非磁性载体具有较大 的比表面，对蛋白等反应速度快，吸附容量大，磁性分离简单快速，巳逐渐应用于细胞、 核酸、蛋白质的分离、亲和层析和放射免疫等生化技术领域。

本发明的技术方案如下：

一种分离纯化糖肽的方法，其特殊之处在于：包括下述步骤

(1)制备肼功能化磁粒 

a清洗

取200毫克环氧化磁粒置于烧瓶中，用水清洗，清洗后将盛有悬浮液的烧瓶放到磁 性分离器上进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；

b反应修饰

向烧瓶中加入50毫升质量分数为5％的水合肼，将烧瓶置于水浴锅中，向烧瓶中插 入搅拌器，再开启搅拌器搅拌使磁粒和水合肼充分混合、反应，将环氧化磁粒修饰成肼 功能化磁粒；

(2)糖肽的分离纯化

a清洗

反应完成后，将肼功能化磁粒用无水乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层 不含磁粒的清液；再用40毫升水重悬，重悬后将悬液保存备用；

b糖蛋白氧化

将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中，加入高碘酸钠至其最终浓度10～ 15毫摩尔，常温避光反应0.5～1.5小时；

c除高碘酸钠

用G-25除盐柱除掉未反应的高碘酸钠；

d糖蛋白偶联

将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的肼功能化磁粒中，室温振荡偶联 4～24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗磁粒3～6次，以除去未共价结合的 蛋白；

e酶解得到糖肽

磁粒上的糖蛋白用5毫摩尔pH为7.8的三羧乙基磷溶于0.1摩尔的碳酸氢氨的溶液 中室温还原30分钟以上；然后加入碘代乙酰胺至其最终浓度为8～15mM，室温继续反 应30分钟以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入胰蛋 白酶至其最终浓度20毫克/升，37℃振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继续酶 解10小时以上；

f清洗

磁粒用2摩尔/升氯化钠溶液和无水乙醇先分别清洗，  再用pH为7.8的0.1摩尔/ 升碳酸氢氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；

e释放糖肽

用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F，37℃ 振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完成糖肽的释放；

一种分离纯化糖肽的方法，其特殊之处在于：包括下述步骤