[发明专利]一种分离纯化糖肽的方法

权利要求书

1.一种分离纯化糖肽的方法，其特征在于，包括下述步骤

(1)制备肼功能化磁粒

a消洗

取200毫克环氧化磁粒置于烧瓶中，用水清洗，清洗后将盛有悬浮液的烧瓶放到磁 性分离器上进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；

b反应修饰

向烧瓶中加入50毫升质量分数为5％的水合肼，将烧瓶置于水浴锅中，向烧瓶中插 入搅拌器，再开启搅拌器搅拌使磁粒和水合肼充分混合、反应，将环氧化磁粒修饰成肼 功能化磁粒；

(2)糖肽的分离纯化

a清洗

反应完成后，将肼功能化磁粒用无水乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层 不含磁粒的清液；再用40毫升水重悬，重悬后将悬液保存备用；

b糖蛋白氧化

将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中，加入高碘酸钠至其最终浓度10～ 15mM，常温避光反应0.5～1.5小时；

c除高碘酸钠

用G-25除盐柱除掉未反应的高碘酸钠；

d糖蛋白偶联

将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的肼功能化磁粒中，室温振荡偶联 4～24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗磁粒3～6次，以除去未共价结合的 蛋白；

e酶解得到糖肽

磁粒上的糖蛋白用5mM、pH为7.8的三羧乙基磷溶于0.1M的碳酸氢氨的溶液中室 温还原20分钟以上；然后加入碘代乙酰胺至其最终浓度为8～15mM，室温继续反应 30分钟以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入胰蛋白 酶至其最终浓度20毫克/升，37℃振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继续酶解 10小时以上；

f清洗

磁粒用2摩尔/升氯化钠和无水乙醇先分别清洗，再用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸 氢氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；

g释放糖肽

用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F，37℃ 振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完成糖肽的释放。