[发明专利]迟缓爱德华氏菌疫苗抗原及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是迟缓爱德华氏菌疫苗抗原及其制备方法。

背景技术

迟缓爱德华氏菌为革兰氏阴性杆菌，具有广泛的宿主范围，包括人类及各种水、陆生动物。在水产养殖动物中，该菌能够感染多种重要淡、海水鱼类，如鲤鱼、罗非鱼、牙鲆、鳗鱼、鳍鱼等。由于迟缓爱德华氏菌能够在所感染的水生动物中诱发一种严重的系统性疾病-爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)，因而对水产养殖业造成巨大的经济损失。

目前对于爱德华氏菌病的防治主要依赖于抗生素(包括各种化学药物)和疫苗免疫两条途径。由于抗生素对动物、人类以及环境所造成的长期性危害，其应用已逐渐在国际上受到限制。疫苗免疫虽然已证明为最为有效的病害防治措施，但就迟缓爱德华氏菌而言，由于其免疫相关基础研究仍在起始阶段，目前世界上应用于水产业的爱德华氏菌疫苗主要为简单的灭活全菌疫苗，尚未有高效的分子疫苗如重组亚单位疫苗等。灭活疫苗虽然安全但往往由于抗原成分和结构在制备过程中被部分破坏而达不到理想的免疫效果。相对而言分子疫苗(重组亚单位疫苗、DNA疫苗等)则具有特异性强、免疫效应较高等特点。因而筛选和获得具免疫保护效应的分子疫苗抗原是爱德华氏菌病免疫防治的关键之一。

发明内容

本发明目的在于提供两种迟缓爱德华氏菌疫苗抗原及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

迟缓爱德华氏菌疫苗抗原：具有序列表SEQ ID No.1。

制备方法：

1)质粒pET258构建：将经BglII/NdeI双酶切的质粒pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌中并在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；

2)质粒构建：以菌株TX1为模板，采用EDF1和EDR1为引物进行PCR扩增，纯化产物后与载体pBS-T载体于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含卡那霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养18-24小时，筛选出白色转化子为质粒pBSED；而后将质粒pBSED用NdeI/XhoI双酶切回收0.58kb，同时将步骤1)的质粒pET258用NdeI/XhoI双酶切回收5.3kb片段；将质粒pBSED用NdeI/XhoI双酶切回收0.58kb与质粒pET258用NdeI/XhoI双酶切回收5.3kb片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取2个转化子提取质粒为质粒pETED；

其中所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，保藏编号为：CGMCC No.2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda；保藏日期：2008年1月9日；

所述引物EDF1  5’-CATATGACGACTATCGACAGCG-3’和EDR1(5’-CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC-3’；

3)质粒的诱导表达：将步骤2)的质粒pETED转化入大肠杆菌中，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子即为BL21/pETED；将BL21/pETED于含有Kn的LB培养基中过夜培养；而后再将培养液加入到新鲜的含有Kn的LB液体培养基中，于37℃摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续摇动培养4-5小时，裂解菌体，离心收集上清，纯化重组蛋白，即为具有序列表SEQ ID No 1的碱基序列的重组保护性疫苗抗原EseD；

其中：培养液与新鲜的含有Kn的LB液体培养基体积比为1∶100；BL21/pETED与含有Kn的LB培养基体积比1∶100。

迟缓爱德华氏菌疫苗抗原：具有序列表No.2中的碱基序列。

制备方法：

1)质粒pET258构建：将经BglII/NdeI双酶切的质粒pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌中并在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；