[发明专利]迟缓爱德华氏菌疫苗抗原及其制备方法

权利要求书

1.一种迟缓爱德华氏菌疫苗抗原，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo.1。

2.一种按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌疫苗抗原的制备方法，其特征在于：

1)质粒pET258构建：将经BglII/Nde I双酶切的质粒pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌中并在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；

2)质粒构建：以菌株TX1为模板，采用EDF1和EDR1为引物进行PCR扩增，纯化产物后与载体pBS-T载体于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含卡那霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养18-24小时，筛选出白色转化子为质粒pBSED；而后将质粒pBSED用NdeI/XhoI双酶切回收0.58kb，同时将步骤1)的质粒pET258用NdeI/XhoI双酶切回收5.3kb片段；将质粒pBSED用NdeI/XhoI双酶切回收0.58kb与质粒pET258用NdeI/XhoI双酶切回收5.3kb片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取2个转化子提取质粒为质粒pETED；

其中所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌；

所述引物EDF1 5’-CATATGACGACTATCGACAGCG-3’和EDR1(5’-CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC-3’；

3)质粒的诱导表达：将步骤2)的质粒pETED转化入大肠杆菌中，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子即为BL21/pETED；将BL21/pETED于含有Kn的LB培养基中过夜培养；而后再将培养液加入到新鲜的含有Kn的LB液体培养基中，于37℃摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续摇动培养4-5小时，裂解菌体，离心收集上清，纯化重组蛋白，即为具有序列表SEQ ID No1的碱基序列的重组保护性疫苗抗原EseD；

其中：培养液与新鲜的含有Kn的LB液体培养基体积比为1∶100；BL21/pETED与含有Kn的LB培养基体积比1∶100。

3.一种迟缓爱德华氏菌疫苗抗原，其特征在于：具有序列表No.2中的碱基序列。