[发明专利]一种口腔致病菌的多重PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口腔常见病原菌伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的多重PCR快速检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

人类口腔中大约寄居着500多种细菌，其中约300余种生长于龈下环境，研究表明几乎所有类型的牙周病都是由牙周菌斑细菌感染所致，但只有少数几种细菌由于单独或协同作用引起牙周组织破坏，细菌及其代谢产生的毒性产物包括细菌的抗原成分，各种酶，毒素及许多代谢产物可直接刺激和破坏牙周组织，或引起牙周组织局部的免疫反应，造成组织损伤，这是导致牙周病变的主要原因。

目前认为牙龈卟啉杆菌和伴放线放线杆菌分别是成人牙周炎和青少年牙周炎特异的病原体，牙龈卟啉单胞菌主要引起牙周组织的急性感染，是成人牙周炎的特异病原体；而伴放线放线杆菌可能是局限性青少年牙周炎的重要致病菌；福塞类杆菌参与成人牙周炎的发生发展；具核梭杆菌也在成人牙周炎和青少年牙周炎发病中发挥作用，这些细菌的检出数量、频率与炎症破坏程度之间存在着正相关关系，其单独或协同作用造成牙周组织的破坏。

牙周炎致病菌的研究一直是研究的热点，建立快速、敏感的检测方法对于研究牙周病的发病机制、监测牙周病的病情变化、确定治疗方案有着非常实际的意义。细菌的分离培养是检测口腔厌氧菌的传统的方法，即将临床标本处理稀释后接种于适当的培养基上，获得单个菌落，再进行染色和生化反应鉴定，但病原菌的培养常受到培养营养要求、标本运送时间及培养时间等因素的限制，一般实验室难以进行，不能满足临床要求。因此人们一直在研究试图找到特异、灵敏和快速的检测方法。随着PCR技术的出现及不断完善，用PCR方法检测病原菌的研究报道越来越多，也越来越成熟。已有文献报道用PCR技术分别检测病原菌的研究报道，受到临床的欢迎，为了进一步提高检测效率，利用多重PCR技术同时扩增4种细菌，但根据一般性原则，在PCR反应中，不同的引物需要选定不同的反应条件才能使PCR反应最佳，在同一反应中，所加引物越多，越难以选择适合的反应条件。在进行多重PCR引物设计中，除应遵循一般引物设计原则，还应注意：1)使所用引物的熔解温度(Tm)尽可能一致，以保证在同一反应条件下的扩增结果；2)尽可能减少所用引物，针对伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌设计了一条共用下游引物；3)使6条引物扩增片段大小有相当的差异，以保证在琼脂糖凝胶电泳中有良好的分辨率。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种口腔致病菌伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的多重PCR快速检测方法，仅通过一次PCR扩增就可同时检测上述四种口腔致病菌。

一种口腔致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR扩增口腔致病菌中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，再通过电泳检测特异基因。

所述多重PCR扩增口腔致病菌中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，包括如下步骤：

1)采用热裂解法提取DNA模板，具体步骤如下：

挑取口腔中待测菌置于200μl裂解缓冲液中，100℃水浴10min，取3μl清液，即得模板DNA，留存备用；

2)多重PCR扩增伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，具体步骤如下：

反应体系：总体积为     25μl

H₂O                    14.25μl，

缓冲液(10×PCR)        2.5μl，

MgCl₂(25mM)            2μl，

dNTP(0.2μM)           1μl，

引物混合液(10μM)      2μl，

DNA聚合酶(0.5U)        0.25μl，

模板DNA                3μl；

引物：

伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌的下游引物为共有引物：

5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’                                  (引物1)；

伴放线放线杆菌的上游引物为：5’-ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG-3’      (引物2)；

福塞类杆菌的上游引物为：5’-TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3’      (引物3)；