[发明专利]一种口腔致病菌的多重PCR快速检测方法

权利要求书

1、一种口腔致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR扩增口腔致病菌中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，再通过电泳检测特异基因。

2、如权利要求1所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增口腔中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，包括如下步骤：

1)采用热裂解法提取DNA模板，具体步骤如下：

挑取待测菌置于200μl裂解缓冲液中，100℃水浴10min，取3μl清液，即得模板DNA，留存备用；

2)多重PCR扩增伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，具体步骤如下：

反应体系：总体积为25μl

H₂O                  14.25μl，

缓冲液(10×PCR)      2.5μl，

MgCl₂(25mM)          2μl，

dNTP(0.2μM)         1μl，

引物混合液(10μM)    2μl，

DNA聚合酶(0.5U)      0.25μl，

模板DNA              3μl；

引物：

伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌的下游引物为共有引物：

5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’                                  (引物1)；

伴放线放线杆菌的上游引物为：5’-ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG-3’      (引物2)；

福塞类杆菌的上游引物为：5’-TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3’      (引物3)；

牙龈卟啉单胞菌的上游引物为：5’-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3’  (引物4)；

具核梭杆菌的上游引物为：5’-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3’       (引物5)；

具核梭杆菌的下游引物为：5’-TTTAGAAATGGTAGAATA AT-3’         (引物6)；

PCR反应循环参数为：

94℃ 5min；94℃ 30sec、55℃ 30sec、72℃ 40sec，30个循环；72℃延伸7min；

吸取14.25μl无菌去离子水加至微离心管中，再依次加入10×PCR缓冲液2.5μl，25mMMgCl₂ 2μl，0.2μM dNTP1μl，10μM引物混合液2μl，0.5U DNA聚合酶0.25μl，模板DNA 3μl，将微离心管置于离心机，10000转/分离心混匀1分钟，再将微离心管放入PCR仪中，按照设定的参数进行PCR扩增反应；制得特异基因溶液；

3)电泳检测鉴定

对上述特异基因溶液进行电泳检测，电泳图中含有长度为360bp、745bp、500bp或197bp相应特征位置条带的一种或多种，分别对应于样本含有伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的一种或多种。

3、如权利要求2所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述步骤1)中的裂解缓冲液为：1.0mmol/L EDTA，1.0％Triton X-100，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。

4、如权利要求2所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述步骤3)电泳检测鉴定的具体操作方法如下：

以TAE缓冲液配制2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，待冷却至50～60℃时，加入溴化乙锭，使溴化乙锭终浓度为1μg/ml，充分混匀，倒入胶膜中，放好梳子，待胶凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使液面高出凝胶表面1～2mm；再将PCR扩增后的特异基因溶液与TAE缓冲液以1∶10体积比混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电，80V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳25～35min后，切断电源，取出凝胶，在紫外光下观察。