[发明专利]欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法

说明书

1、技术领域

本发明涉及生物技术领域内的兽病诊断技术，具体是一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法。

2、背景技术

PRRS的发生和流行，已给我国的养猪业造成了相当大的经济损失。但是目前，对该病的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。为了更好地预防和控制本病的发生和流行，当务之急是要建立一种可靠的、适于大规模诊断与检测PRRS的方法。PRRS感染常用的诊断方法有细胞培养、RT-PCR。但是，这些诊断方法在应用中耗时长、工作量大、需要特殊的仪器和设备，远远不能满足当前诊断PRRS感染的需要，尤其不适合大规模的临床样本检测与开展流行病学调查。

PRRSV分为美洲型与欧洲型两种基因型，欧洲地区主要流行欧洲型，而美洲及亚太地区则以美洲型为主。目前，我国所分离获得的毒株大多数属于美洲型，赵耘等通过分子生物学及血清学方法鉴定了一株欧洲型PRRSV，预示现在我国猪群中可能同时存在欧、美型PRRSV。二者的ORF7编码的病毒结构蛋白都具有良好的抗原性，且N蛋白核苷酸序列型内保守，型间差异较大。因此，本研究在N蛋白的基础上剔除了欧、美型PRRSV型间保守的抗原表位，利用原核表达的融合蛋白作为抗原，建立一种适用于大规模检测PRRS抗体的间接ELISA方法，首次在国内人工合成了欧洲型PRRSV N蛋白型特异性抗原表位，建立了检测欧洲型PRRSV抗体的ELISA方法；以期为我国PRRS的诊断与检测和血清学调查提供快捷的技术手段。

3、发明内容

本发明的目的是研制一种能够区分欧、美洲型的PRRS抗体检测试剂盒，最终为大规模的临床样本检测与开展流行病学调查提供一种有效的试剂盒。

本发明专利是通过以下技术方案实现的：

1)目的蛋白的表达及纯化：

PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建了针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用纯化试剂盒进行蛋白纯化。

2)欧、美型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立：

利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV N蛋白分别建立间接ELISA方法，确定了美洲型N蛋白抗原包被浓度为4.5μg/mL，欧洲型N蛋白抗原包被浓度为8μg/mL；抗原包被条件均为37℃1h加4℃包被过夜；血清的稀释度均为1∶40，30min作为美洲型N蛋白包被时血清的最适工作时间，60min作为欧洲型N蛋白包被时血清的最适工作时间；均使用1％的BSA封闭，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度均为1∶1000，结合时间均为30min；美洲型N蛋白包被时，样本OD450≥0.43，判定为阳性；OD450值＜0.43的判定为阴性；欧洲型N蛋白包被时，样本OD450≥0.40，判定为阳性；OD450值＜0.40的判定为阴性。不论何种抗原包被，对猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病阳性血清的OD450值均小于0.40，均为阴性，表明该重组蛋白抗原与猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小的阳性血清没有交叉反应，说明ELISA方法具有良好的特异性，均可以用于PRRS抗体的检测。

欧洲型PRRSV阳性血清与美洲型N蛋白包被板发生交叉反应，美洲型PRRSV阳性血清与欧洲型N蛋白包被板也发生交叉反应，两者OD450值均略高于阴阳性临界值，但都远低于同型血清与同型抗原的反应值，表明所建立的针对欧洲型及美洲型PRRSV的间接ELISA方法可区分欧洲型及美洲型毒株的感染，但需进一步优化待检血清稀释度，使交叉反应的OD450均低于阴阳性临界值。

本发明的方发所具有的积极效果是，由于国内目前为止尚未发现欧洲型PRRSV感染，获得的欧洲型PRRSV阳性血清的量有限，交叉反应问题暂时还未得到解决。检测欧洲型PRRSV感染的ELISA检测方法的建立为猪病检测提供了技术储备。

4、附图说明

附图1是重组蛋白GST-N的纯化产物；

图中1：为全分子量蛋白质标准；2：为包涵体溶解后的上清；3～5：为过柱纯化后的蛋白。

附图2是重组蛋白HIS-N的纯化产物；

图中1低分子量蛋白Marker，2～5分别为亲和层析纯化收集第4管、第3管、第2管、第1管蛋白。

附图3是重组蛋白GST-N的Western-Blot分析；