[发明专利]欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法

权利要求书

1、欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

1)目的蛋白的表达及纯化：

针对PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用表达纯化的蛋白为抗原，建立欧洲型PRRS抗体试剂盒和美洲型PRRS抗体试剂盒；

2)欧、美型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立：

利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV N蛋白分别建立间接ELISA方法，确定美洲型N蛋白抗原包被浓度为4.5μg/mL，欧洲型N蛋白抗原包被浓度为8μg/mL；抗原包被条件均为37℃1h加4℃包被过夜；血清的稀释度均为1∶40，30min作为美洲型N蛋白包被时血清的工作时间，60min作为欧洲型N蛋白包被时血清的工作时间；使用1％的BSA封闭，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度均为1∶1000，结合时间均为30min。

2、根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，针对美洲型N蛋白ELISA(GST-N-ELISA)，确定抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.43，即当样本OD₄₅₀≥0.43，判定为阳性；OD₄₅₀值＜0.43的判定为阴性。

3、根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，针对欧洲型N蛋白ELISA(HIS-N-ELISA)，确定抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.40，即当样本OD₄₅₀≥0.40，判定为阳性；OD₄₅₀值＜0.40的判定为阴性。

4、根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包被的抗原对猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病阳性血清的OD₄₅₀值均小于0.40，均为阴性，表明该重组蛋白抗原与猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小的阳性血清没有交叉反应，证明ELISA方法具有良好的特异性，适用于PRRS抗体的检测。