[发明专利]促进灵芝次生代谢产物合成的细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物细胞培养方法，尤其涉及一种通过在灵芝液体深层发酵过程中添加诱导子从而促进灵芝多糖和灵芝酸生物合成的灵芝细胞培养方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

灵芝(Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Krast)，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属，是一种珍贵的药用真菌，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化等，在中国已有两千多年的历史。自古以来，一直被人们视为延年益寿的珍品，是滋补强壮、扶正固本、有利于维持机体平衡的名贵中药。灵芝在东南亚地区具有悠久的药用历史，我国人民把它作为药物也已经有两千余年的历史，始载于《神农本草经》。灵芝多糖是灵芝中一类具有广泛生物活性的代谢产物，在许多研究中，经证实对肝癌、白血病等具有良好的抑制作用。灵芝三萜类化合物(主要是灵芝酸)分为四环三萜和五环三萜，从灵芝四环三萜类化合物的结构来看，属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有抗肿瘤及抗HIV-I、HIV-I激酶的活性。这两大类活性物质均属于次生代谢产物，含量很低，不利于大规模的产业化生产，因而，需要找到一种可以提高次生代谢产物产量的有效方法，以克服现有技术存在的缺陷。

细胞培养法生产灵芝酸和灵芝多糖等有效成分，由于生产周期短、需要劳动力少以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的方法。Roja等报道了壳多糖能促进雪兰莪草培养物中阿拉伯半乳聚糖的生物合成(Roja，G.Bhangale，A.S.Juvekar，A.R.Eapen S.D’Souza S.F.Enhanced production of the polysaccharidearabinogalactan using immobilized cultures of Tinospora cordifolia by elicitation and insitu adsorption.Biotechnol.Prog.2005，21，1688-1691)。Satdive等披露了麦角菌制备的诱导子能在印度楝树培养过程中促进印楝素(一种四环三萜类物质)的大量合成(Satdive R.K.Fulzele D.P.Eapen S.Enhanced production of azadirachtin by hairy rootcultures of Azadirachta indica A.Juss by elicitation and media optimization.J.Biotechnol.2007，128：281-289)。但至今仍缺乏一种能够有效促进或提高灵芝次生代谢产物生物合成的细胞培养方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的灵芝细胞培养方法中所存在的灵芝多糖和灵芝酸产量低的缺陷，提供一种能够有效促进或提高灵芝次生代谢产物(尤其是灵芝多糖和灵芝酸)生物合成的细胞培养方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种促进灵芝次生代谢产物合成的细胞培养方法，包括将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中，在液体深层发酵过程中向发酵液中添加由真菌菌丝体所制备的诱导子。

为了达到更好的技术效果：

优选的，在灵芝细胞对数生长期的末期向发酵液中加入由真菌菌丝体所制备的诱导子；更优选的，在液体深层发酵的第8天向发酵液中加入由真菌菌丝体所制备的诱导子。

所加入的诱导子的浓度优选为60毫摩尔/升。

所述的真菌优选为橘青霉(Penicillium citrinum)、中国块菌(Tuber sinense)、德国块菌(Tuber aestivum vittad)、或黑孢块菌(Tuber melanosporum)。这些真菌菌种都可从各种商业途径购买得到。

所述的诱导子可以是以下三种诱导子中的任一种：(1)全成分诱导子：包含真菌菌丝体中的大部分成分(含多糖、蛋白和脂类)；(2)多糖蛋白诱导子：主要包含真菌菌丝体中的多糖和蛋白类成分；(3)多糖诱导子：主要包含真菌菌丝体中的多糖类成分。

每种真菌的菌丝体都可以按照现有的方法制备成上述三种诱导子中的任一种。

作为参考，上述的三种诱导子可分别参考以下方法制备得到：

(1)全成分诱导子的制备方法：真菌菌丝体过滤收集并用去离子水冲洗两次，然后浸泡于醋酸盐缓冲液中匀浆，匀浆液高速离心，取上清液，高压灭菌，即得。

(2)多糖蛋白诱导子的制备方法：