[发明专利]制备和纯化因子VIII及其衍生物的方法

说明书

背景技术

因子VIII是参与血凝结的血浆糖蛋白。它的功能的缺乏或异常导致严重的 遗传疾病，称为血友病(Eaton，D.等人，1986，Biochemistry 25：505-512； Toole，J.J.等人，1984，Nature 312：342-347；Vehar，G.A.等人，1984， Nature 312：337-342)。到目前为止，血友病的唯一治疗方法是静脉施用从人 体血液或重组来源制备的因子VIII。基于安全考虑，重组因子VIII优选血浆 衍生因子VIII。然而，由于因子VIII的表达水平低于相同表达体系的其它分 子2到3个数量级(Lynch C.M.，1993，Human Gene Therapy 4：259-272)， 重组因子VIII的制备不能满足它的需求。

一些尝试通过将已知在因子VIII的辅因子活性中没有任何功能的B结构域 除去已经实现了因子VIII的更好的表达(Eaton等人，1986，Biochemistry 25： 8343-8347；Burke，R.L.等人，1986，J.Biol.Chem.，261：12574-12578； Toole，J.J.等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：5939-5942；Fay et al，.1986，Biochem.Biophys.Acta，871：268-278)。美国专利US 5,661,008和WO-A-91/09122描述了因子VIII的B结构域的缺失形式，与血浆 因子VIII的最短的形式相似。美国专利US5,112,950和US7,041,635公开了缺 失B结构域的因子VIII分子的单链形式。

作为哺乳动物细胞表达的一种选择，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达体系已 经被用于制备许多包含因子VIII的治疗蛋白(Chu，L.等人，2001，Curr.Opin. Biotehnol.，12：180-187)。CHO细胞系的特性被阐明。它可以以依赖贴壁的 方式或者以悬浮方式生长，适合含血清或者不含血清的培养基，尤其支持几乎 与人体糖基化模式相同的蛋白质的翻译后修饰(Brooks S.A.，2004，Mol. Biotechnol.，28：241-255；Jenkins，N.，等人，1996，Nat.Biotechnol.，14： 975-981；Chen，Z.，等人，2000，Biotechnol.Lett.，22：837-941；Mols，J.， 等人，2005，41：83-91)。为了解决动物性病毒或朊病毒的传染的安全性问题， 并且为了更容易纯化，产生治疗蛋白的CHO细胞系通常在不存在动物性蛋白的 培养基中培养。(Chu，L.，等人，2001，Curr.Opin.Biotehnol.，12： 180-187)。然而，从培养基中移除血清也使血清补充物中天然包含的蛋白酶抑 制剂丧失并且使在制备过程中维持细胞的生存力变得困难(Mols，J.，等人， 2005，41：83-91；Sandberg，H.，等人，2006，Biotechnol Bioeng.，95： 961-971)。

降低的生存力和产生压力的环境似乎增加了从死细胞中分泌或者释放的蛋 白酶的产生，它会攻击治疗蛋白，引起异质性。由治疗蛋白内部切割引起的异 质性可能是主要问题，因为被切割的蛋白会失活，使在制备和纯化过程中保持 “逐批”一致性变得困难。因此，在制备过程中保持一个相对低水平的蛋白酶或 者阻止蛋白酶的活性很重要。

防止这种在培养过程中从CHO细胞系中释放的蛋白酶引起的蛋白质水解的 几个成功的成果已经被报道，即使可以应用于CHO细胞系中产生的所有治疗蛋 白的通用抑制剂(们)还没有被发现。Satoh M等报道了从CHO细胞系中释放 的半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶的存在。Chotteau等(Chotteau，V.，等人，2001， in Animal cell technology：from target to market，Kluwer Academic publishers，pp.287-292)发现了来自CHO细胞系培养基的一种未经确认的细 胞外的金属依赖的蛋白酶是造成截短的因子VIII的蛋白质水解的原因。在 WO-A-90/02175中，公开了一些来自CHO细胞培养中的丝氨酸或者半胱氨酸蛋 白酶可以被抑制肽阻滞，这使因子VIII的生产力增加。EP A0306968公开 了将抑肽酶加入到培养基中使因子VIII在CHO细胞培养基中的表达提高了3 倍。