[发明专利]测定一种样品中激活的因子Ⅶa(FⅦa)浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定一种样品中激活的因子VII(FVIIa)浓度的方法， 该方法利用一种缺乏因子VII(FVII)和从因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX) 和因子XI(FXI)选出的至少一种其它因子的血浆。

背景技术

血液凝固是一种使机体在血管损伤的情况下能够控制流血从而避免 出血的机制。

血液凝固是按照一种级联方式分步发生的，它涉及血液中不同的酶 原(proenzymes)和前协同因子(procofactors)通过蛋白水解酶转化 为它们的激活形式。在凝血的一系列步骤(或级联)中，能够区分为两 条路径，定义为外源性凝血路径和内源性凝血路径。它们均导致称为凝 血酶原酶的复合物的生成，它包括激活的因子X(FXa)、激活的因子V (FVa)、磷脂和钙。凝血酶原酶激活凝血酶原成为凝血酶，使水溶性血 纤维蛋白原转化为形成血凝块的不溶性血纤维蛋白。

所述外源性路径涉及血浆中FVII的作用。然而，它之前必须被激活成 为FVIIa，以启动所述的凝血级联。FVIIa单独(未被复合)具有低蛋白水 解活性。当FVIIa与组织因子(tissue factor，TF)复合时，该活性被 强化，组织因子是一种在血管损伤情况下被释放的缔合磷脂的蛋白。所 述FVIIa-TF复合物在钙离子存在下将因子X转化为因子X a。所述FVII a-TF复合物也将FIX转化为FIXa，从而催化所述内源性凝血路径。反过 来，因子IXa和Xa激活FVII成为FVIIa。因子Xa，与因子Va和所述磷脂 (凝血酶原酶)复合，将凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶作用于血纤维蛋 白原，将其转化为血纤维蛋白，并且还具有将因子V转化为Va和将因子 FVIII转化为FVIIIa的其它活性。在钙的存在下，凝血酶还激活因子XIII成 为允许血纤维蛋白血凝块凝固的因子XIIIa。

尽管在外源性凝血路径中，FIX被所述FVIIa/TF复合物激活成为FIX a，在内源性凝血路径中，FIX通过自身被因子XII激活的FXIa生成为FIXa， 因子XII通过血液和一种负电表面如内皮下膜(sub-endothelium)接触而 激活。

因此，FVIIa，一种依赖于维生素K的糖蛋白，在凝血机制中起重要 作用，导致血凝块形成。FVIIa具有如下优点：它能在组织损伤导致出血 后释放，甚至在没有因子VIII或IX下，在所述组织因子存在下局部发挥作 用。这就是FVIIa已经使用多年以矫正一些导致流血的凝血紊乱症的原因。

第一种方法是从血浆中获得FVIIa。然而，从血浆生产FVIIa受供应源 可用性的限制，并且这种血浆的使用带有传播致病因子如朊病毒和病毒 的风险。诺和诺德制药有限公司通过开发一种重组FVIIa(rFVIIa)而解决 这些问题，该重组FVIIa为结构类似于血浆FVIIa的糖蛋白。

rFVIIa的主要治疗适应症(在美国、欧洲和日本)是自发或者手术致 出血的治疗，该出血发生在已经发展出抗因子VIII抗体的A型血友病个体 和已经发展出抗因子IX抗体的B型血友病个体。在欧洲，它也被验证在 先天性FVII缺乏症的患者和患有血小板无力症(Glanzmann’s thrombasthenia)的患者中使用。

此外，大量出版物报道rFVIIa在手术中控制患者出血的有效性，所 述患者既没有所述凝血因子的先天缺乏也没有血小板无力症。

这种FVIIa不断拓宽的使用已经导致FVIIa活性测定方法和FVIIa浓度 测定方法的开发，例如测定一种潜在含有FVIIa的样品的浓度，或者测定 患者中FVIIa血浆浓度以证实FVIIa的给药量很好地适用于需被矫正的止 血紊乱(haemostasis disorder)，并且被治疗的患者没有处于一种低 凝血或高凝血状态。

检测FVIIa活性的最著名的方法是测定凝血时间、PTT(部分促凝血 酶原激酶时间)、aPTT(激活的部分促凝血酶原激酶时间)、TEG(凝血弹 性描记法)和TGT(凝血酶生成试验)。使用这些方法，可能测定FVIIa 活性，但不能直接测定FVIIa的精确浓度。

FVIIa浓度的直接测定，如由FVIIa产生的FXa的荧光或者显色测定， 已经证明是不合适的，因为它们不能区分FVIIa和FVII的效果。