[发明专利]利用HPLC在制备级上纯化RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用HPLC在制备级(制备规模)上纯化RNA的 方法以及多孔反相在该方法中作为固定相的应用。

背景技术

HPLC(“高效(高压)液相色谱”的缩写)是一种已建立的用 于分离物质的混合物的方法，该方法广泛用于生物化学、分析化学 以及临床化学中。

在最简单的情况下，HPLC装置包括带有洗脱液储器(装有流 动相)的泵、加样系统、装有固定相的分离柱、以及检测器。此外， 还可以提供流分收集器，利用该流分收集器可以在分离以后分别收 集单独流分，且单独流分因此可用于进一步的应用中。

从A.Azarani和K.H.Hecker(Nucleic Acids Research，vol.29，no. 2 e7)中已知利用离子对反相HPLC进行的RNA分析。其中的固定 相由非多孔烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯基质构成。用两种洗脱液的 缓冲体系进行洗脱。缓冲液A由0.1M乙酸三乙铵(TEAA)的水 溶液组成(pH7.0)，而缓冲液B由0.1M TEAA的水溶液(pH7.0) 以及25％乙腈组成。利用以下三种梯度体系进行洗脱：38-40％B 经1分钟，至60％B经15分钟，至66％B经6分钟，至70％B经 0.5分钟，至100％B经0.5分钟，在100％B下保持1分钟，至38％ 经1分钟，在38％B下保持2分钟。可替换地，使用以下梯度程序： 38-60％经30分钟，至100％B经2分钟，至38％B经3分钟。以 下用作第三梯度程序：38-40％B经1分钟，至60％B经3分钟， 至100％B经1分钟，在100％B下保持6分钟，至38％B经1分 钟，在38％B下保持1分钟。

因此，这种HPLC方法涉及使用相对复杂且昂贵的梯度程序。 此外，这种方法仅能分离和分析最多达1000ng(1μg或0.001mg) 的分析量的RNA。

发明内容

本发明的目的是改进这种方法，达到使其不再具有现有技术缺 点的效果。

根据本发明，通过用于在制备级(制备规模)上纯化RNA的 方法实现上述目的，该方法的显著区别在于使用多孔反相作为固定 相利用HPLC来纯化RNA。因此，在根据本发明的方法中，一个 重要因素是使用多孔反相。

在本发明的上下文中，术语“利用HPLC”应包括可以用来实施 本发明方法的各种HPLC方法以及低压或常压液相色谱法。这些 HPLC方法可以包括反相HPLC(RP-HPLC)、色谱法、尺寸排阻色 谱法、凝胶过滤、亲和色谱法、疏水作用色谱法或离子对色谱法， 其中反相HPLC是优选的。简言之，反相HPLC包括非极性的固定 相和中等极性的流动相。例如，一种常用的固定相是用诸如 RMe₂SiCl处理过的二氧化硅，其中R是诸如C₁₈H₃₇或C₈H₁₇的直链 烷基。因此，对于本身非极性更强的分子，保留时间会更长，从而 使得极性分子更容易洗脱。通过向流动相中加入极性溶剂可延长保 留时间，而加入疏水性更强的溶剂则可缩短保留时间。

然而，上述各种技术是基于疏水作用的原理而操作的，疏水作 用是由相对极性的溶剂、相对非极性的分析物、以及非极性的固定 相之间的排斥力而引起的(反相原理)。分析物(RNA分子)结合 于固定相的驱动力是分析物分子暴露于溶剂的非极性部分面积的 减少。这种疏水效应受控于自由能的降低(来自与有序分子-极性溶 剂界面的极小化有关的熵)。通过向流动相中加入非极性更强的溶 剂可以降低疏水效应。这会使分配系数发生变化以致分析物经一定 时间在流动相中沿柱下移，最终从柱洗脱。

作为分析物的特定RNA分子的特性在其保留特性方面可以起 到重要作用。通常，具有非极性更强的官能团的分析物导致更长的 保留时间，因为它使分子的疏水性提高。然而，非常大的分子会导 致较大分析物表面和烷基链之间的不完全相互作用。保留时间随疏 水表面积的增加而增加，其中疏水表面积与溶质大小大致成反比。 因为总表面积减小，支链化合物比它们的相应异构体更快速地被洗 脱。