[发明专利]基于泛蛋白修饰的α螺旋区的人工结合蛋白

说明书

本发明涉及源自泛蛋白样蛋白的蛋白质超家族、在其α螺旋区具有修 饰的结合蛋白。本发明还涉及用于产生这些蛋白的方法以及可通过所述方 法获得的蛋白。此外，本发明提供蛋白质用于特异性识别、结合和中和前 述靶分子，用于检测、定量测定、分开和/或用于分离相应的结合配偶体的 用途，和本发明蛋白质用于诊断、预防和治疗直接或间接涉及相应的结合 配偶体的疾病的用途。

发明背景

泛蛋白是小单体胞质蛋白，其序列高度保守，并存在于从原生动物到 脊椎动物的所有已知的真核细胞中。在生物体中，它在调节细胞蛋白的受 控降解中起关键作用。为了该目的，指定用于降解的蛋白在它们经过酶级 联过程中与泛蛋白或多泛蛋白链共价连接，并由于该标记被选择性降解。 根据近期的结果，泛蛋白或由泛蛋白标记蛋白，也分别在其他细胞过程诸 如引入若干蛋白或其基因调节中起重要作用(Marx，2002)。

除澄清其生理功能外，泛蛋白是研究的目标，主要是因为其结构和蛋 白质化学特性。泛蛋白的多肽链由以特别紧凑的α/β结构方式折叠的76 个氨基酸组成(Vijay-Kumar，1987)：几乎87％的多肽链通过氢键的方式参 与二级结构元件的形成。明显地，二级结构可以涉及三个半α-螺旋转角以 及一个由四条链组成的反向平行β-折叠。这些元件的特有排列——反向平 行β折叠暴露于这样的蛋白质表面，在所述蛋白质表面的背面上堆积垂直 位于其上部的α螺旋——通常被视为所谓的泛蛋白-样折叠基序。因此， 泛蛋白是分别关于各种蛋白质超家族(“泛蛋白-样蛋白”)或蛋白质家族 (“泛蛋白-相关蛋白”)给出的名称(Murzin等，1995)，其包括携带这种 基序以及在其一级序列中与泛蛋白高度同一的蛋白质诸如例如SUMO-1 (Müller等，2001)、FAU(Michiels等，1993)、NEDD-8(Kumar等，1993)、 UBL-1(Jones和Candino，1993)、和GDX(Filippi等，1990)。

人泛蛋白是——如上所述-76个氨基酸长的多肽(图1)。它是7,5kDa 的、具有突出的C-端的小的球状蛋白。泛蛋白的主要结构性质显示在图1 中。来自所述折叠和来自所述螺旋的疏水性残基装配所述蛋白的疏水性核 心并稳定所述螺旋的方向(图2)。所述蛋白质核心的高度密集的疏水性堆 积通过其优秀的热力学稳定性反映，这应该使所述蛋白成为作为蛋白质工 程方法支架使用其的理想候选者。

由于它的小尺寸，泛蛋白的人工制备可以通过化学合成和通过生物技 术的方法进行。由于有利的折叠特性，泛蛋白可以通过使用微生物诸如大 肠杆菌(Escherichia coli)的遗传工程以相对大的量在细胞质或者在壁膜 间隙中产生。由于在周质中主要为氧化条件，通常将后一方案留作用于产 生分泌蛋白。由于简单和有效的细菌制备，泛蛋白可以用作其它要被制备 的其生产有难度的外源蛋白的融合配偶体。通过与泛蛋白融合的方法，可 以获得提高的溶解性和因此提高的产量。本发明中实施的用于提供泛蛋白 作为通用的人工结合蛋白的方法容许其蛋白质化学特性的完全新颖性的 利用。

在诊断学和制药学中使用其天然功能的那些蛋白质中，免疫球蛋白起 主要作用。它们与广泛范围的不同底物的特异性、非-共价结合能力使它们 成为用于生物科学应用的最重要工具。近年来开发的用于在大肠杆菌中功 能生物合成抗体片段的方法进一步扩展了使用免疫球蛋白的可能性，但同 时证明了它们的局限性。