[发明专利]基于泛蛋白修饰的α螺旋区的人工结合蛋白

权利要求书

1.用于生成蛋白的方法，所述蛋白选自由“泛蛋白-样蛋白”蛋白超 家族的蛋白、及其各具有泛蛋白-样折叠基序的片段或融合蛋白组成的组， 其中所述蛋白由于对在α螺旋区中的一个或多个氨基酸的修饰而显示出关 于试剂的提高的结合亲和性，所述结合亲和性在未修饰的蛋白质中不存在 或不以该程度存在，所述方法具有下列步骤：

a)选择“泛蛋白-样蛋白”超家族的未修饰蛋白；

b)提供所述未修饰蛋白对其具有低的或不具有结合亲和性的试剂；

c)选择在包括α螺旋区的蛋白质表面-暴露区中的氨基酸；

d)优选地通过取代、插入、缺失和/或化学修饰而修饰所选择的氨基 酸，其中所述α螺旋或相邻区域中的至少4个表面-暴露的氨基酸被修饰；

e)使所述修饰的蛋白与步骤b)中提供的试剂相接触；

f)检测和分离关于步骤b)中提供的试剂具有新或增高的结合亲和性 的蛋白，和任选地进行下述步骤：

g)在合适的原核、真核或体外表达系统中或通过化学合成生成所述 修饰的蛋白；

h)在生成后通过合适的纯化方法分离所述蛋白；和进一步任选地

i)通过重复步骤d-h)进行所述修饰的蛋白的熟化。

2.按照权利要求1的方法，其中步骤d)通过化学合成所述修饰的蛋 白而进行。

3.按照权利要求1的方法，其中步骤d)中的修饰是通过遗传工程从 而改变属于相应的修饰蛋白的DNA进行的。

4.按照权利要求1的方法，其中在步骤d)中构建基因文库。

5.按照权利要求1的方法，其中在步骤d)中通过随机诱变进行所选 择的氨基酸的随机取代。

6.按照权利要求1的方法，其中在步骤e)中，与所述试剂的所述接 触通过合适的选择方法，优选地，噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、 CIS展示或细胞表面展示方法、酵母表面展示、细菌表面展示，特别优选 通过噬菌体展示方法进行。

7.按照权利要求1的方法，其中在步骤f)中，针对所述试剂具有结 合亲和性的蛋白的检测通过下列方法中的一种或多种进行：ELISA、胞质 基因表面共振光谱法、荧光光谱法、FACS、等温滴定热量测定或分析式 超速离心法。

8.按照权利要求1的方法，其中利用本身已知的方法，针对其结合亲 和性、其结合特异性和/或其他蛋白质化学特性诸如稳定性、溶解性、或产 量熟化所述蛋白质。

9.按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述蛋白以位点-特 异性或随机方式与至少一种相同或不同特异性的蛋白共价连接，由此获得 二价、多价或双特异性蛋白。

10.按照权利要求1-9中一项或多项的方法，其中选择用于修饰的蛋 白与人泛蛋白具有至少30％的氨基酸序列同一性，且具有泛蛋白-样折叠 基序，和/或属于“泛蛋白-相关蛋白”蛋白家族。

11.按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中选择用于修饰的蛋 白具有泛蛋白-样折叠基序并优选选自由下列各项组成的的组：SUMO-1、 FAU、NEDD-8、UBL-1、Rub1、APG8、ISG15、URM1、HUB1、GDX、 伸蛋白B、PLIC2(N-端结构域)，人帕金蛋白(N-端结构域)。

12.按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述蛋白是人泛蛋 白或其他哺乳动物泛蛋白。

13.按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述修饰包括5-10 个氨基酸，优选6-8个氨基酸的相邻区域，其中优选地，其2-4个氨基酸 位于所述α螺旋的表面-暴露区。

14.按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述α螺旋的氨基 酸被修饰，且任选另外地，在位于所述α螺旋外的螺旋上游位置或螺旋下 游位置中的氨基酸被修饰。