[发明专利]α-1,6-岩藻糖基转移酶表达的SHRNA介导的抑制

说明书

本发明涉及RNAi领域。更精确地，本发明涉及降低酶的翻译的领域， 所述酶催化重组产生的蛋白质如诊断或治疗性抗体的修饰。

发明背景

RNAi介导的基因沉默现象首次描述于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)系统，其中报导了显微注射长的双链RNA分子导致各自基因的 失活(US 6,506,559)。后来，公开了在脊椎动物(EP 1 114 784)、哺乳动物， 尤其在人类细胞(EP 1 144 623)中的RNAi介导的基因沉默。在这些系统中， 如果将19-29bp的短的双链RNA分子转染以便暂时击倒特定目的基因， 那么成功地实现了基因失活。

RNA介导的基因失活机理似乎在迄今研究的多种生物中稍微不同。然 而，在所有系统中，RNA介导的基因沉默是基于内切核酸酶Argonaute2 诱导的靶mRNA的转录后降解，Argonaute2是所称作的RISC复合体的 部分(WO 03/93430)。降解的序列特异性通过装入RISC复合体的特定反义 RNA链的核苷酸序列决定。

适当的导入可能性包括转染双链RNA分子自身或者DNA载体构建体 的体内转录，其直接导致短的双链RNA化合物，该RNA化合物具有与靶 RNA分子的部分同一的序列。在许多情况下，所称作的shRNA构建体已 经被成功用于基因沉默。这些构建体编码茎环RNA，其特征在于导入细胞 后，其被加工成双链RNA化合物，其序列对应于最初RNA分子的茎。

IgG 1型免疫球蛋白具有两个N-连接的寡糖链，其结合到Fc区的 Asn297位或者在一些情况下结合到Asn298位。N-连接的寡糖通常为复 杂的双触角型，由三甘露糖基核心结构组成，存在或不存在核心岩藻糖 (Rademacher，T.W.，等人，Biochem.Soc.Symp.51(1986)131-148； Umana，P.，等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Okazaki，A.，等 人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Shinkawa，T.，等人，J.Biol.Chem. 278(2003)3466-3473)。

US 2004/0132140和US 2004/0110704报导了用于抑制表达重组抗体的 细胞系内α1，6-岩藻糖基转移酶的重组或遗传方法。

发明概述

本发明包括在哺乳动物细胞中产生具有降低的岩藻糖修饰程度的异 源多肽的方法，包括

-在适合表达该异源多肽的条件下培养哺乳动物细胞，

-从所述哺乳动物细胞或培养物回收所述异源多肽，

其中所述哺乳动物细胞用SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核酸和 编码异源多肽，优选编码作为异源多肽的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或 免疫球蛋白缀合物的核酸转染，所述SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的 核酸被转录为针对α1，6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA。

在一个实施方案中，shRNA的转录处于Pol III启动子，优选U6启动 子的控制下。在一个实施方案中，哺乳动物细胞额外用编码新霉素选择标 记的核酸转染。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO来源的细胞。 在一个实施方案中，哺乳动物细胞用单一核酸转染，该核酸包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的第一核酸、编码新霉素选择标记的第二核酸和编 码异源多肽的第三核酸，所述第一核酸被转录为针对α1，6-岩藻糖基转移酶 的shRNA。

本发明还包含核酸，其包含选自SEQ ID NO：5和6的核酸的第一核 酸、编码新霉素选择标记的第二核酸，和编码异源多肽的第三核酸，所述 异源多肽选自包括免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和免疫球蛋白缀合物的异 源多肽。

本发明还报导了包含根据本发明的核酸的细胞。

发明详述

本发明包括在哺乳动物细胞中重组产生具有降低的岩藻糖修饰程度 的异源多肽的方法，所述哺乳动物细胞包含转录成shRNA的核酸和编码 所述异源多肽的核酸，所述方法包括用所述核酸转染哺乳动物细胞，在适 于表达该异源多肽的条件下培养转染的哺乳动物细胞，并从哺乳动物细胞 或培养物回收所述异源多肽，其中在哺乳动物细胞中，通过所转录的针对 α1，6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA降低了α1，6-岩藻糖基转移酶的酶 活性。