[发明专利]制备微粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备微粒的方法，特别是制备壳多糖微粒(CMP)的方 法。本发明还涉及在药物组合物中配制微粒的方法，以及制备包含微 粒的试剂盒的方法。

介绍

Shibata等人的研究(1-4)已经表明，口服递送1μm至10μm的可吞 噬壳多糖颗粒引起小鼠脾细胞培养物中Th1细胞因子的增多。这种效果 对于该微粒是特异性的，因为可溶性壳多糖不产生增多。这还能够使 用壳多糖的主要成分N-乙酰基-D-葡糖胺包被的1μm聚苯乙烯微球再 现。还证实了在豚草变态反应的鼠科模型中口服给予壳多糖下调血清 IgE和肺嗜曙红性(1)。

Shibata等人还开发了过敏性气道炎症的小鼠模型并向小鼠口服 给予壳多糖制剂(Shibata 2000)。在向豚草致敏小鼠日口服给予壳多糖 之后，免疫接种之前和期间，豚草特异性IgE水平显著下降。

当预防性地给予小鼠壳多糖，然后给予豚草时，IL-4，IL-5和IL-10 的产生显著减少而且量低，但是检测到了显著的IFN-γ水平。

壳多糖在给予C57BL6小鼠时还具有预防作用，与BALB/c小鼠 相比，所述C57BL6小鼠是细胞介导的免疫/Th1反应的较高应答者， 但是其是过敏反应的较低应答者。当用豚草和壳多糖同时处理豚草致 敏小鼠时，IL-4，IL-5和IL-10的产生水平与仅有豚草刺激的那些相 比显著下降。

在我们早前的专利申请WO 03/015744中，我们描述了一些小鼠 实验。这些实验证明鼻给药的CMP盐水悬浮液具有有益的免疫调节性 质，这些性质能够应用在治疗过敏性疾病上，且能通过先天免疫机理 的上调提高对滤过性毒菌和细菌引起的呼吸道感染的保护。这些有益 的免疫调节性质还能够应用于从自然杀伤(NK)细胞活性和/或干扰素 -γ分泌的上调引起的疾病状态，如癌症的治疗。

在我们早前的专利申请US 60/815074中，我们描述了CMP在疫 苗组合物中作为佐剂的应用。特别地，当CMP组合物与另一种佐剂例 如霍乱毒素B亚单位(CTB)结合的时候，CMP组合物还被发现具有协 同提高对来自于传染性试剂的抗原的保护的能力。

目前的证据表明要使CMP达到最优的效用，颗粒应当微粉化且其 粒径在1至20μm的范围。CMP的主要作用机制取决于巨噬细胞和其它 吞噬细胞的吞噬作用，因此，CMP必须在一般认为的1至20μm可吞噬 的范围。

壳多糖的生产来源是河虾处理工业的副产物河虾壳废料。河虾壳用 酸和碱处理以除去矿物质和蛋白污染物。然后将纯化的壳多糖絮片体用 标准碾磨法碾碎以制备粒径范围在100至200μm的粉末。这是CMP生 产的起始原料。

在Shibata和Strong描述的方法中(3，5)，壳多糖粉末是用实验室 里的声波降解法微粉化的。然而，这种方法具有不能放大至工业生产 需要的缺点。并且，对于不溶性多糖例如壳多糖的微粉化，也没有建 立合适的货物生产质量管理规范实践(GMP)协议的建立。还存在另一 问题在于通常使用的声波降解法是用于团块的分解和细胞的剪切，该 声波降解法不能生产均一粒径的CMP微粒。

发明概述

鉴于上述缺陷，我们研究了其它能够减小粒径的方法，例如空气 喷射碾磨法和干粉球磨法，这更适用于工业放大。空气喷射碾磨法是 制药工业中将均一的药物粉末生产成片剂的选择的方法。然而，当我 们将空气喷射碾磨法作为生产CMP的方法时，我们发现经过三次过辊 压炼后平均粒径仍然大于100μm，这表明此种方法对于生产CMP完 全无效。我们还发现干粉球磨法是不能令人满意的生产CMP的方法， 因为要生产接近于可吞噬尺寸的微粒所需要的时间过多，即天的量级， 且尽管如此，平均尺寸在约50μm而不是期望的10μm。此外，过多 的碾磨时间有可能从器皿到金属球产生金属污染。

微流化仪器(微流化仪)以前用于涂料和墨水的生产。然而，我们 现在惊讶地发现微流化仪器也可用于生产可吞噬尺寸的CMP，也因此 由微流化仪器生产出来的CMP适合于作为药物使用和药物组合物的 配制。特别地，我们发现用微流化仪器生产CMP的优点包括具有处理 大体积的能力以及放大至工业生产需要的简单性；GMP协议已被提 出；与其它方法相比，它更好地控制微粒尺寸以生产均一产物；以及 与其它方法相比，它的CMP产率更高。