[发明专利]以高产率生物产生正丁醇的方法

说明书

发明领域

本发明包含通过经代谢改造的(metabolically engineered)微生物将可发酵 的碳源以高产率生物转化为正丁醇的方法。

发明背景

正丁醇是无色、中等挥发性的中性液体，在水中的混溶性有限(约7-8％)， 但是与所有常规溶剂如二醇、酮、醇、醛、醚、和芳族及脂族烃可自由混溶。 正丁醇用于i)制备其它化学品，ii)作为溶剂和iii)作为配方产品(formulated product)如化妆品中的成分。正丁醇作为原料的主要用途是在丙烯酸酯/甲基 丙烯酸酯、乙二醇醚、乙酸正丁酯、氨基树脂和正丁胺的合成中。目前世界 上每年消耗超过9百万吨的正丁醇。

更近一段时间，已经证明了正丁醇是一种优于乙醇的生物燃料，原因在 于更低的蒸气压、更高的能含量(接近于汽油的能含量)和水存在条件下更低 的分离易感性。此外，正丁醇可以按比乙醇更高的浓度用于标准车辆引擎， 并且它不需要汽车制造商为了符合环保法规而在性能上作出让步；正丁醇同 样适合于在管道中输送，并因此有潜力迅速引入汽油中且避免对额外的大规 模基础供应设施的需求。

正丁醇可以通过产溶剂梭菌属(solventogenic Clostridia)的糖发酵作用作 为丙酮/正丁醇/乙醇(ABE)混合物产生。ABE发酵分两个阶段。在第一产酸 阶段期间，高生长速率伴随着乙酸和丁酸的产生。在第二产溶剂阶段中，生 长速率降低并产生溶剂(ABE)，伴随着对第一阶段产生的有机酸的消耗。在 整个发酵过程中产生二氧化碳和氢。

正丁醇的生物产生(示于图1)需要形成丁酰辅酶A作为中间物，丁酰辅 酶A依赖于生理条件能够通过由adhE1和adhE2编码的两种不同的双功能 醛-醇脱氢酶还原。丁酰辅酶A也可以通过分别由ptb和buk基因编码的磷酸 转丁酰酶(phospho-transbutyrylase)和丁酸激酶转化成丁酸。丙酮通过分别由 ctfAB和adc基因编码的辅酶A转移酶和乙酰乙酸脱羧酶从乙酰乙酰辅酶A (丁酰辅酶A产生过程中的中间物)产生。氢通过由hydA基因编码的仅作用 于铁的氢化酶产生。当在氢化酶抑制剂一氧化碳存在下进行培养时，正丁醇、 乙醇和乳酸是主要发酵产物。乳酸通过由ldh基因编码的乳酸脱氢酶从丙酮 酸产生。

具有失活的buk基因(通过与不可复制的质粒进行单交换获得)的丙酮丁 醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株在文献中已有描述(Green等，1996)。 将具有0.8kb内部buk片段的不可复制的载体pJC4BK整合入染色体buk基 因，导致了内源基因的失活。将获得的菌株根据该质粒的名称命名为“突变 体PJC4BK”。如这篇文献中所明确的，由于这种类型的基因失活的不稳定性， 即能够通过质粒切除而回复成野生型，所以这种基因整合未完全消除酶活 性，也未完全消除丁酸形成。其后将这种突变菌株使用在数项研究中(Green 和Bennett，1998；Desai和Harris，1999；Harris等，2000)。

在传统上，商用ABE发酵仅以分批模式进行，原因是生产型梭菌属 (producing Clostridia)的连续培养不稳定性。已经描述了几种产生溶剂的发酵 方法。这些方法以6∶3∶1的比例产生正丁醇、丙酮和乙醇。在文献中已经报 道了可发酵碳源29-34％的溶剂产率(单独的正丁醇为18-25％)。由于产生的 正丁醇的毒性，16-24g/l的总溶剂浓度和10-14g/l的正丁醇浓度通常是极限。 然而，溶剂的这些低效价(titre)似乎不再是所述方法的经济学限制，因为最近 已经证明在发酵过程中能够通过使用“低成本”气提技术来回收溶剂。

有待本发明解决的问题是获得无丁酸激酶活性的稳定突变体菌株，其能 够培养几代而无任何回复成野生型基因型的可能性。这种菌株可用于从廉价 的碳底物如葡萄糖或其它糖通过遗传稳定的梭菌属培养物以高产率生物产 生正丁醇。对于工业上可行的正丁醇产生方法，用于失活的生化步骤的数目 和代谢调节的复杂性使得使用经代谢改造的全细胞催化剂成为必需。

发明内容