[发明专利]使用源自 Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法

说明书

本发明涉及制备对映异构体富集的(enantiomerically enriched)苯丙 氨酸化合物的方法，其中使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨 酶时与氨基供体反应。

对映异构体富集的苯丙氨酸化合物是例如药物制品的重要中间体，尤 其是在对血管紧张素I转化酶抑制剂(ACE)的制备中，ACE被用于治疗高 血压(high blood pressure，也作hypertension)。例如，光学活性的(S)-吲 哚啉-2-羧酸((S)-indoline-2-carboxylic acid)(可通过(S)-2-氯苯丙氨酸闭环制 备)可用于制备[2S-[1[R^*(R^*)，2a，3ab，7ab]]-1-[2-[[1-(乙氧羰基)丁基]氨基]- 1-氧代丙基]八氢-1H-吲哚-2-羧酸，后者也作为商品名培哚普利(Perindopril) 已知，其可用作抗高血压药(ACE抑制剂)或强心药(cardiotonic)活性成 分。其它有用的应用为例如喷托普利(Pentopril)和吲哚普利(Indolapril)。

从WO2006/069799 A1可获知制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物 的工艺，其中在一个特定的实施例中，通过在存在来自R.glutinis的苯丙 氨酸氨裂解酶(PAL)时将3-(2-氯-苯基)丙烯酸与水性NH₃反应，来制备(S)- 2-氨基-3-(2-氯-苯基)-丙酸。来自Rhodotorula glutinis的氨基酸序列可见 WO 01/11071 A2和本文的SEQ ID NO.9。

WO2006/069799 A1中所述工艺的缺点是发生底物抑制。因此，该工 艺需要在低浓度下运行。因此为了生产可接受量的产物，需要大体积或复 杂的补料方案，使得从商业观点来看该工艺较不吸引人。

因此，提供下述工艺是本发明的一个目的，所述工艺用于制备苯丙氨 酸化合物，其中底物抑制被降低。

该目的已通过工艺方法达成，所述工艺用于制备对映异构体富集的苯 丙氨酸化合物，其使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与 氨基供体反应，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQ ID NO.4具有至少50％的序 列同一性。

因此，本发明的工艺提供了用于制备苯丙氨酸化合物的改进的和/或有 商业吸引力的工艺。通过使用与SEQ ID NO.4具有至少50％的序列同一 性的PAL，底物抑制得以降低(即随着底物浓度的提高，酶最初活性的降 低)。另外，在E.coli中容易地过表达了与SEQ ID NO.4具有至少50％ 同一性的苯丙氨酸解氨酶(PAL)。与SEQ ID NO.4具有至少50％同一性的 PAL与来自R.glutinis的PAL相比的另一优点是它们具有更高的活性。

在使用Clone Manager 6(6.00版/align Plus 4，4.10版(Scientific& Educational Software))的序列比对研究中，使用BLOSUM62作为评分矩阵 来测定本文定义的％同一性。

优选地，在本发明的工艺中，使用的PAL与SEQ ID NO.4具有至少 50％，更优选地至少53％，更优选地至少55％，更优选地至少57％，进一 步更优选地至少60％，进一步更优选地至少62％，进一步更优选地至少 65％，进一步更优选地至少70％，尤其是至少75％，更尤其是至少80％， 更尤其是至少85％，更尤其是至少90％，进一步更尤其是至少95％，进一 步更尤其是至少97％，进一步更尤其是至少98％，进一步更尤其是至少 99％，最尤其是100％的序列同一性。