[发明专利]制备胰岛素样生长因子-1与聚(乙二醇)的偶联物的方法

权利要求书

1.制备赖氨酸聚(乙二醇)化IGF-I或IGF-I变体的方法，所述变体包 含的选自第27位、第65位和/或第68位赖氨酸的一个或两个氨基酸独立 地被另一个极性氨基酸取代，所述聚(乙二醇)化是单聚(乙二醇)化或二聚 (乙二醇)化，且所述聚(乙二醇)具有20至100kDa的总分子量，其特征在 于：

a)培养包含表达载体的原核宿主细胞，所述表达载体含有编码融合蛋 白的核酸，所述融合蛋白包含的所述IGF-I或IGF-I变体的N末端与前肽 的C末端连接，由此Gly-Pro是IGF-I或IGF-I变体的前两个氨基酸；

b)所述前肽C末端以氨基酸-Y-Pro终止，其中Y是Pro-Arg-Pro，

c)回收并聚(乙二醇)化所述融合蛋白，

d)用IgA蛋白酶切割所述聚(乙二醇)化的融合蛋白，所述IgA蛋白酶 是来自淋球菌2型的IgA蛋白酶，并

e)回收所述聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I变体。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述前肽由通式 Met-X₁-His_n-X₂-Y-Pro-表示，其中

·Met表示甲硫氨酸

·X₁是键、丝氨酸或天冬酰胺

·His是组氨酸

·n是从0至10之间的数字，

·X₂是选自肽SEQ ID NO：6-10的接头肽，

·Pro是脯氨酸，并且

·Y是Pro-Arg-Pro。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述前肽不包含赖氨酸残基。

4.权利要求1的方法，其特征在于所述极性氨基酸独立地是精氨酸、 谷氨酰胺或天冬酰胺。

5.权利要求1的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体在第65位和第68位赖氨酸处被单聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

6.权利要求5的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体是携带氨基酸R27、R65、K68的RRK并且所述变体在第68位赖氨 酸处被单聚(乙二醇)化，或所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I变体是携带氨 基酸R27、K65、R68的RKR并且所述变体在第65位赖氨酸处被单聚(乙 二醇)化。

7.权利要求5的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体是携带氨基酸R27、K65、K68的RKK，并且所述变体在第65位和 第68位赖氨酸处被单聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

8.权利要求5的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体是携带氨基酸R27、R65、K68的RRK、携带氨基酸R27、K65、R68 的RKR或携带氨基酸R27、K65、K68的RKK的混合物，并且所述变体 在第65位和第68位赖氨酸处被单聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

9.权利要求1的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 被随机单聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

10.权利要求1的方法，其特征在于所述聚(乙二醇)基团是分支的二聚 (乙二醇)基团。

11.包含赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I变体的融合蛋白，所述 聚(乙二醇)化是单聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化，且所述聚(乙二醇)具有 20至100kDa的总分子量，所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I变体包含的 选自第27位、第65位和/或第68位赖氨酸的一个或两个氨基酸独立地被 另一个极性氨基酸取代，Gly-Pro是IGF-I或IGF-I变体的前两个氨基酸， 其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I变体N末端与前肽 的C末端连接，所述前肽C末端以氨基酸-Y-Pro终止，其中Y是 Pro-Arg-Pro。