[发明专利]用胚胎干细胞制备转基因禽类的方法

说明书

本发明涉及禽类生物技术并特别涉及制备转基因鸟类的方法。本 发明特别用于制备在卵中大量表达重组目的蛋白质的转基因鸟类。

在过去的十五年中，治疗领域增长加速，已有超过400种生物分 子用于临床发展，市值超过300亿美元。绝大多数重组蛋白质需进行 特异性翻译后修饰以获得全部生物学活性并因此必须在大规模生物反 应器中在哺乳细胞内生长而制备。与此生产系统相关的成本以及需要 重要的定量是使整个生产过程的发展更加延迟的原因。在上下文中， 转基因动物可代表经济上有吸引力的替代物，尤其是如果修饰可通过 种系传递至子代时。

家兔、山羊和牛引起人们极大的兴趣，长时间以来雌鸡被认为是 在鸡卵中制备重组治疗性蛋白质的最吸引人的快速、成本经济的生物 学制备系统。由于商业化雌鸡一年产卵约250枚，每枚卵含有近4克 卵白蛋白，所以鸡的产卵能力的确是非常强的。如果每枚卵仅可产100 mg重组蛋白质，那么一小群1000只雌鸡的鸡群每年可产25kg粗制重 组蛋白质物质。此外，由于数十年来用鸡卵生产许多种人用疫苗，商 业性产卵工业已高度自动化且管理机构与鸡卵衍生产品相适应。

同样，家禽工业也对使用转基因的方法加快商业目的的遗传性状 的选择产生兴趣(即“meta克隆技术”)。这个想法将绕过经典选择方 案：[谱系→GGP→GP→PS]而以较短的时间得到目的鸡。家禽生产中 最可能用到的转基因技术可能是在转基因植物中是常见技术的增加抗 病性或改进食物的同化作用的技术。此外，转基因技术可能是保存禽 类遗传资源的策略。迄今为止，将谱系动物(家禽工业最有价值的动 物)分成不同地域是唯一的可在饲养场发生麻烦(例如病毒的传染) 时，防止多年的选择项目丧失的方法。这种方法是昂贵的且不能保证 可以抗衡国家卫生决定(强制对所有的本地家禽进行预防性消除以检 查病毒感染)(如2003年在荷兰进行的)。

改良动物的工程化首次意味着可将转基因稳定导入动物的基因组 中。25年来研究DNA导入的不同技术有：(i)DNA微量注射技术，(ii) 病毒转导技术，(iii)精子介导的基因转移技术，(iv)核转移技术，(v) 基于细胞的使用原始生殖细胞的转移技术，或(vi)基于细胞的使用胚 胎干细胞的转移技术。已验证，在鸡中，仅有DNA微量注射技术(Love 等人，1994Biotechnology 12：60-63)和病毒转导技术(Bosselman等人， 1990J.Reprod.Fertil.Suppl.41：183-195)可有效地进行转基因的种系 传递。然而，这两种技术都有一些限制：这两种技术繁琐、艰苦并且 效率低，其部分原因是由于转基因的随机整合和沉默。病毒转导技术 还使插入到病毒载体上的转基因的大小受到限制。现在这两种技术不 能达到与商业发展相适应的蛋白质表达水平。

将之前体外遗传工程化的原始生殖细胞(PGC)或胚胎干细胞(ES) 注射到发育中的鸡胚中的技术是禽类转基因技术中有前途的技术之 一，尤其是因为这些技术可使靶转基因整合入基因组内的可使转基因 高表达的特异位点。然而，为使用该方法制备转基因鸡，必须满足重 要的先决条件：体外操作时细胞必须存活，而同时保持其插入到受体 胚胎的能力，以定居于生殖细胞内并然后将修饰传递给子代。