[发明专利]具有促胰岛素活性的生物活性多肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种体系，该体系通过克隆天然肽或基因工程形式的肽并在遗传修饰的微生物(如酵母)中表达而制备促胰岛素肽(例如Exendin-4)，其中氨基肽酶基因被破坏从而能够有效表达全长的蛋白或多肽。 

背景技术

Exendin是降低血糖水平并与GLP-1具有部分序列相似性(53％)的一系列肽(Goke等，1993 J.Biol.Chem.268；19650-19655；以参考方式引入本文)。在大毒蜥(Gila Monster)(希拉毒蜥(Heloderma suspectum)；Raufman 1996 Reg.Peptides，61；1-18；以参考方式引入本文)和墨西哥连珠蜥蜴(Mexican beadedlizard)的毒液中发现了exendin。在大毒蜥的毒液中发现的Exendin-4尤其受关注。Exendin-4前体是包括信号和前序列(prosequence)的87个氨基酸的多肽(Sequence ID No：1)。对其进行加工以得到酰胺化的39个氨基酸的Exendin-4(Sequence ID No：2)。公开的PCT国际专利申请WO 98/35033(以参考方式将其内容引入本文)公开了编码proexendin肽(包括exendin和其它新型肽)的cDNA、它的分离、以及特异性识别这种肽的抗体(Pohl等，1998，J.Biol.Chem.273；9778-9784；以参考方式引入本文)。Exendin-4已经显示出在分离的大鼠胰岛素瘤细胞中是GLP-1受体的强激动剂。与GLP-1相比其还具有更长的生物半衰期(Young等1999 Diabetes 48；1026-1034；以参考方式引入本文)。这是可以预期的，因为活性GLP-1((Sequence ID No：3)中被DPP-IV识别的His-Ala结构域不存在于Exendin-4中，而是以序列His-Gly替代。 

系统性给予的Exendin-4能降低糖尿病db/db小鼠的血糖水平40％(WO99/07404；以参考方式引入本文)。Eng的美国专利5,424,286(以参考方式将其内容引入本文)公开了N-末端序列的相当一部分对于保留促胰岛素活性是必需的。 

肽序列中的氨基酸残基数目对通过固相合成化学制备多肽的生产成本有显著影响。制备50肽(50-mer peptide)的成本比10肽的成本高至少5倍。固相肽合成还需要使用诸如TFS和氢氟酸等腐蚀性溶剂，需要以许多合成步骤来制备肽，并且需要后续的肽纯化。因此，需要一种对用于制备大量具有生物活性的Exendin-4和其它促胰岛素肽的高效并节省成本的方法。 

在毕赤酵母或其它微生物中表达重组蛋白或多肽并不总是能够成功制备全长多肽。通常，异源重组多肽/蛋白在细胞内受到蛋白酶的切割/降解。考虑到蛋白的结构和存在于细胞中的蛋白酶的多重性，在许多情况中被蛋白酶识别或靶向的氨基酸序列的特异性是未确定的并且未被发布。因此本领域的技术人员未必总是可能推测哪种蛋白酶负责切割/降解特定的重组多肽/蛋白。例如，已有报道在毕赤酵母中表达鼠或人内皮抑素(endostatin)会得到缺失C-末端赖氨酸的产物(Folkman等，1999 May；15(7)：563-72)。当酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的KEX-1基因的毕赤酵母同源物被破坏时，毕赤酵母宿主可将全长的内皮抑素分泌到培养基中。在另一项研究中，有报道在毕赤酵母中KEX-2而非YPS-1基因的缺失可制得哺乳动物明胶，其在蛋白的单精氨酰位点(monoarginylic site)被切割(Werten和de Wolf，Applied andEnvironmental Microbiology，2005 May；71(5)：2310-7)。 

本发明证明：通过使酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物中断，可阻止在N-末端具有氨基酸HG(His-Gly)的蛋白/多肽的体内蛋白水解切割。非常明确的是，已经显示通过使酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物中断，解决了与甘氨酸-延长的Exendin-4(GlyExendin-4，具有C-末端甘氨酸的Exendin-4前体)的蛋白水解切割相关的问题。 

GLYEXENDIN-4 

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSG(Sequence IDNo：4) 

发明内容

发明目的： 

本发明的主要目的是制备生物活性多肽。