[发明专利]基于由Gi-偶联受体调节的cAMP水平的体外测定

说明书

技术领域

本发明涉及基于由Gi-偶联受体调节的cAMP水平的一种体外测定(体外分析，in vitro assay)。

背景技术

G-蛋白偶联受体(GPCR)代表人类基因组中最大的超家族之一。它们与大量生理紊乱和疾病有关，因此代表一种用于药物制剂和药物发现的重要目标。目前正在开发的全部药物中大约60％针对GPCR(Lundstrom et al.，Trends Biotechnol.，2005，23，103-108)。

GPCR，特征在于它们的7个跨膜结构域，可由多种胞外刺激物如神经递质、激素、光和增味剂激活。

异源三聚体G蛋白由3个亚单位构成：α亚单位(35kDa)家族、β亚单位(35-36kDa)家族和γ(6-10kDa)亚单位家族。通过将与Gα亚单位结合的鸟苷-5’-三磷酸(鸟苷三磷酸，GTP)更换为鸟苷-5’-二磷酸(鸟苷二磷酸，GDP)，激动剂结合引起受体的活性构象改变以及随后的G蛋白激活(Kristiansen，K.，Phamacol Ther，2004，103，21-81)。然后，Gα从Gβγ二聚体解离导致下游效应物如腺苷酸环化酶、离子通道和磷脂酶通过Gα或Gβγ二聚体而激活。

目前存在不同形式的合适测定，涵盖对GPCR信号传导过程中三个主要步骤的利用，包括配体结合和功能分析(综述参见GreasleyP.J.and Jansen，F.P.，Drug Discovery Today：Technologies，2005，2，2，163-169)。这些步骤包括配体与受体的结合、活性构象中配体介导的受体稳定化导致核苷酸交换(Gα亚单位中GTP更换为GDP)，最终，随后偶联至不同的胞内第二信使途径。

偶联于GPCR的G蛋白包括四个家族Gq、Gs、Gi和G_12/13(综述参见Wong，S.K.-F.，Neurosignals，2003，12，1-12)，与特异性第二信使途径的偶联将依赖于受体的G蛋白优选性和所采用激动剂的性质(Akam，E.C.et al.，BrJPharmacol.，2001，132，4，950-8；Wong，S.K.-F.，Neurosignals，2003，12，1-12)。

Gq偶联受体的激活导致磷脂酶C的激活，从而诱导钙贮存经由肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)的生成而释放。该途径的功能分析主要基于细胞，且利用钙和IP3信号。

Gs和Gi偶联受体的激活导致腺苷酸环化酶的激活(Gs)或抑制(Gi)，分别引起胞内cAMP水平的增加或减少。多种利用荧光或发光读数的测定形式可应用于胞内cAMP的测量(综述可参见Williams，C.et al.，Nat Rev Drug Discov.，2004，3，2，125-35)。对Gs偶联受体，这些测定形式可提供满意的结果。

然而，对于Gi偶联受体，要利用这些技术来获得可行性测定则比较困难。检测由Gi偶联受体诱导的效应要求通过毛喉素(福司柯林，forskolin)进行预激活以刺激腺苷酸环化酶并生成cAMP，且通过将激动剂结合于Gi偶联受体上而介导的cAMP生成抑制很少超过利用毛喉素的刺激的60％。此外，测量通过拮抗剂对由于毛喉素对腺苷酸环化酶活性预刺激所导致Gi受体激动剂介导cAMP降低的反转也增加了复杂性(Greasley P.J.and Jansen，F.P.，DrugDiscovery Today：Technologies，2005，2，2，163-169)。

克服这些局限性的一种方式是通过利用嵌合(Gqi5)或广宿的G蛋白(G_16/15)，将Gi偶联受体的正常药理学效应物从腺苷酸环化酶转化为PLCβ途径(Lui，A.M.，et al.，J.Biomol.Screen，2003，8，39-49)。然而，已证实采用非同源G蛋白可诱导受体/G-蛋白相互作用的显著改变，从而降低测定的关联性。

用于测定cAMP浓度的其他方法包括报道基因测定(Kent，T.Cet al.，Journal of Biomolecular Screening，2005，10，5，437-446)。然而，在这种情况下，测量一个二次事件(这里为报道基因的激活或抑制)会增加筛选中假阳性或假阴性干扰的产生。