[发明专利]基于由Gi-偶联受体调节的cAMP水平的体外测定

权利要求书

1.利用基于受一个细胞中所表达的Gi偶联受体调节的cAMP水平的一种体外测定的筛选、鉴定或选择试验化合物的一种方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在一个选定的细胞中，可任选地鉴定与所述胞内cAMP水平的调节有关的Gαi和腺苷酸环化酶同种型；

(b)在所述选定细胞中，相对于受毛喉素或NKH-477刺激但对Gαi抑制不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)，促进受毛喉素或NKH-477刺激并且对Gαi抑制敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(A)的影响；

(c)使所述细胞与毛喉素或NKH-477以及一种试验化合物接触；以及

(d)检测由所述试验化合物与所述细胞接触而导致的cAMP水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b)通过使所述细胞与NKH-477接触而实现。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于受毛喉素或NKH-477刺激但对Gαi抑制不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)而促进受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi抑制敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(A)的影响是通过使受毛喉素或NKH-477刺激但对Gαi蛋白抑制不敏感的腺苷酸环化酶同种型特异性地失活而实现。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述失活通过下调所述受毛喉素或NKH-477刺激但对Gαi蛋白抑制不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)的表达而获得。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述选定的细胞中表达的受毛喉素或NKH-477刺激但对Gαi抑制不敏感的所述一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)是通过特异性RNAi下调。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述特异性RNAi是特异性miRNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述腺苷酸环化酶VII同种型是通过利用特异性miRNA而敲减。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述选定的细胞是选自一种哺乳动物细胞或一种酵母细胞的一种真核细胞，或者选自CHO系、HEK系或昆虫SF9系的一种已建立的细胞系。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述选定的细胞是CHO-K1或CHO-S细胞系。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，对所述试验化合物与所述细胞接触所得cAMP水平的测量是经由利用读数如荧光或发光的技术而实施。

11.用于测量与一种细胞受体进行特异性相互作用并调节其活性的试验化合物对cAMP水平的调节的一种测定系统或试剂盒，所述测定系统或试剂盒包括主要表达受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi抑制敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(A)的细胞。

12.根据权利要求11所述的测定系统或试剂盒，其中，所述细胞稳定地共表达：i)多个核酸序列，这些核酸序列编码一种特定Gαi蛋白或者受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi蛋白抑制敏感的一个或多个特定腺苷酸环化酶同种型(A)；ii)以及特异性miRNA，该miRNA针对编码受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi蛋白抑制不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)的腺苷酸环化酶转录本。

13.从一个选定的细胞经工程改造得到的一种重组细胞，所述选定的细胞既表达受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(A)又表达受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)，其中相对于受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型的影响，受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型的影响被促进。

14.根据权利要求13所述的重组细胞，其中，受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(A)的表达被上调。

15.根据权利要求14所述的重组细胞，其中，受毛喉素或NKH-477刺激且对Gαi不敏感的一个或多个腺苷酸环化酶同种型(B)被失活。