[发明专利]在油包水乳液中的微粒上的单分子PCR

说明书

【01】本申请要求于2006年6月19日提交的美国临时申请系列第60/814,585号的权益，在此明确并入其全部公开内容。

【02】由于来自包括CA43460、CA57345和CA62924在内的NIH的基金，美国政府保留本发明的一些权利。

技术领域

【03】本发明涉及DNA分析领域。具体地，它涉及单种类DNA分子的扩增和分离。

背景技术

【04】在20世纪做出的最重要生物技术进步包括将单DNA分子转化成相同DNA分子群的方法。为了这个目的，第一次技术浪潮应用细胞(克隆)，第二次浪潮应用PCR。在发源于单个分子的群通过克隆过程被内在地分离方面，克隆是有益的。相反，如果产物要保持分离的话，基于PCR的方法对于每个模板而言需要单独的区室(试管)。乳液PCR通过使区室微型化克服了这种缺点，因此，百万计的模板可以在单个试管中被单独地扩增。

【05】一旦乳液被破坏，通过将在每个区室内形成的产物保持在一起，BEAMing(珠子、乳液、扩增和磁学)在乳液PCR上建立。这通过下列过程完成：(i)将珠子引入区室内，以及(ii)确保一个PCR产物链与珠子结合。在扩增之后，每个珠子被涂敷存在于区室内的数千拷贝的单DNA分子，该区室包含珠子且这些珠子可以容易地用磁铁或通过离心作用被回收。

【06】通过BEAMing得到的珠子精确地反映了存在于模板群内的DNA多样性，并且可以被用于决定哪部分的DNA种群包含特定的突变。因为每个珠子包含数以千计的同一序列的分子，因此用杂交或酶试验得到的信噪比极高。使用传统的流式细胞术或光学扫描仪器可以在几分钟内分析数以百万计的珠子。与珠子结合的DNA也提供优良的模板，用于高通量测序。

【07】本领域内对提高DNA扩增的通量以改进DNA分析和遗传诊断存在持续的需求。

发明内容

【08】根据本发明的一个实施方式，提供了分析核苷酸序列变异的方法。形成包括油相和水相的微乳液。该水相包括一种或多种分析物DNA分子。10-30％(v/v)的微乳液是水相以及70-90％(v/v)的微乳液是油相。油相包括：数量为油相的60-85％(v/v)的一种或多种低粘度烃，其具有在25℃下为20mPas以下的粘度；数量为10-30％(v/v)的一种或多种高粘度烃，其具有在25℃下为20mPas以上的粘度；以及数量为5-10％(v/v)的乳化剂。在试剂珠存在下微乳液中的分析物DNA分子被扩增。该试剂珠与用于扩增分析物DNA分子的引物的多个分子结合。形成与一种分析物DNA分子的多个拷贝结合的产物珠。将该产物珠与未被结合到产物珠的分析物DNA分子分离。测定与产物珠结合的所述一种分析物DNA分子的序列特征。

【09】本发明提供了液体组合物。其包括形成含水区室的多种微乳液，其中至少一部分所述含水区室包括珠子、多核苷酸模板和用于扩增所述模板的寡核苷酸引物。至少一部分寡核苷酸引物与珠子结合。微乳液包括油相和水相。10-30％(v/v)的微乳液是水相以及70-90％(v/v)的微乳液是油相。油相包括：数量为油相的60-85％(v/v)的一种或多种低粘度烃，其具有在25℃下为20mPas以下的粘度；数量为10-30％(v/v)的一种或多种高粘度烃，其具有在25℃下为20mPas以上的粘度；以及数量为5-10％(v/v)的乳化剂。

【10】本发明的另一个实施方式是分离核苷酸序列变体的方法。形成了包括油相和水相的微乳液。水相包括一种或多种分析物DNA分子。10-30％(v/v)的微乳液是水相以及70-90％(v/v)的微乳液是油相。油相包括：数量为油相的60-85％(v/v)的一种或多种低粘度烃，其具有在25℃下为20mPas以下的粘度；数量为10-30％(v/v)的一种或多种高粘度烃，其具有在25℃下为20mPas以上的粘度；以及数量为5-10％(v/v)的乳化剂。在试剂珠存在下微乳液中的分析物DNA分子被扩增。该试剂珠与用于扩增分析物DNA分子的引物的多个分子结合。形成结合于一种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠。将该产物珠与未与产物珠结合的分析物DNA分子分离。使结合于第一种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠与结合于第二种分析物DNA分子的多个拷贝的产物珠分离。