[发明专利]质谱法生物标记测定

说明书

本发明涉及对生物标记的测定。特别是，本发明描述了能够通过 质谱法自动筛选样品中生物标记的存在的多重测定。

多种生物学标记，称为生物标记，已经通过生化和分子生物学应 用于医学和毒理状态而被鉴定和研究。生物标记可在组织和生物液中 发现，所述血液是用于生物标记研究的最常见生物液。

生物标记可具有可预测的能量，并且因而可用于预测或检测特定 病症或疾病的存在，水平，类型或阶段(包括特定微生物或毒素的存 在或水平)，对特定病症或疾病的易感性(包括遗传易感性)，或对特 定治疗的反应(包括药物治疗)。据认为，通过提高研究和研发计划的 效能，生物标记将在药物发现和研发的未来起着越来越重要的作用。 生物标记可用作诊断试剂，疾病进展的监控物，治疗的监控物和临床 结果的预测物。例如，多种生物标记研究计划正试图鉴定特定癌症和 特定心血管和免疫疾病的标记物。

完整的蛋白可利用基于凝胶以及液相的分离技术以多种方式测 定。使用了具有溶解的蛋白的二维凝胶电泳，其中蛋白根据电荷和大 小被分离。蛋白被分离，使得同质异构形式以及翻译后的修饰分离。 通过染色技术定量蛋白，其中可利用预染色和后染色技术。代谢标记 也允许线性范围延伸多达5个数量级，提供毫微微摩尔(femtomolar) 范围内的灵敏度。从切除的凝胶斑进行蛋白鉴定。化学降解和修饰之 后消化蛋白。产生的肽混合物从分离的凝胶样品中抽提，并且然后通 过质谱法鉴定。

多维HPLC(高效液相色谱)可用作分离蛋白或肽的良好的替代方 法。蛋白或肽混合物连续通过产生更高分辨率的色谱固定相或维度。 HPLC对于许多实验方法是灵活的，并且可由于它们在分离感兴趣的特 定蛋白或肽类中的适宜性和相互之间以及与下游检测和鉴定质谱方法 的兼容性而选择多种固定和活动相。高效液相色谱法目前对于溶质分 离是最好的方法，其也允许高度再现地自动化操作。这些类型的多装 置分离平台的在线构造普遍地应用于蛋白质组学研究中。

质谱法(MS)也是一种蛋白质组学领域的关键要素。事实上，MS 是此领域中用于研究和表征纯化蛋白的主要工具。蛋白质组和MS的 界面连接，展现出数百或数千的蛋白，是通过凝胶技术产生的，其中 在单个凝胶上可获得高分辨率。研究者正成功地利用MS的能力以代 替原先给予蛋白质组动力的二维凝胶。

质谱法(MS)的应用和发展以鉴定通过液相分离技术和/或基于凝 胶的分离技术分离的蛋白质或肽已经在蛋白质和肽表达分析中产生了 显著技术进步。对于蛋白质和肽的质谱表征有两种主要的方法：基质 辅助激光解吸电离(MALDI)和电雾化离子化(ESI)。利用多种方法， MALDI和ESI离子来源可与飞行时间(TOF)或其他类型的质谱分析 法组合以确定肽的质量或序列。

在MALDI中，肽与基质共结晶，并且用激光脉冲。这种处理使肽 蒸发和离子化。带电的肽的分子量(质量)然后在TOF分析器中确定。 在这种装置中，电场加速了带电分子朝向检测器，并且其使得离子化 的肽到达检测器的时长的差异(它们的飞行时间)揭示了肽的分子量， 更小的肽更快地到达检测器。这种方法产生了肽混合物的质量轮廓- 也就是，混合物中肽的分子量和数量的轮廓。这种轮廓可然后用于从 蛋白质序列数据库中鉴定已知的蛋白质。

通过将ESI-MS界面制备到液相色谱(LC/MS/MS)，来自LC-柱的 洗脱肽被引入质谱仪的离子源中。对非常细的针施加电压。然后所述 针将液滴喷入质谱分析器中，在其中所述液滴蒸发并且肽离子相应于 各种电荷状态并从测定序列的位置释放，所述电荷状态是分段的 (fragmented)。在LC/MS/MS中，研究者利用了微毛细管LC装置以 最初分离肽。

质谱法(MS)是一种有价值的分析技术，因为它高度灵敏地测量 生物分子的内在性质。因此MS可用于测量宽范围的分子类型(蛋白， 肽，或任何其他生物分子)和宽范围的样品类型/生物材料。正确的样 品制备已知对于MS信号产生和光谱分辨和灵敏度是关键的。样品制 备因此对于分析的总的可行性和灵敏度是关键的。