[发明专利]分离胎儿滋养层

说明书

发明领域

本发明涉及分离从怀孕雌性哺乳动物获得的胎儿滋养层(胎盘)细胞的方法，更具体地说，涉及用释放滋养层的试剂处理宫颈粘液样品，再更具体地说，涉及在实验室机构接受从怀孕雌性获得的样品后约8小时内，提供对符合FISH等检验要求的胎儿滋养层样品的方法。

发明背景

衍生自胎儿的细胞可获得有关胎儿的遗传学和/或生物化学信息。通过分离妊娠早期的滋养层细胞，可利用这些细胞获得胎儿遗传学和/或生物化学信息，特别是可用于检测人类胎儿异常。

多年来，一直利用通过羊膜穿刺术或绒毛膜取样(CVS)获得的胎儿细胞进行产前检验。羊膜穿刺术通常在妊娠约16周时进行，需要熟练人员将针头插入胎儿的羊膜囊，取出20-30ml的羊水。随后可对羊水含有的胎儿细胞实施检验。然而，这种获得胎儿细胞的方法伴有诱导自发流产的危险。此外，如果根据该16-周方法的胎儿细胞遗传学诊断显示异常，而在妊娠中期三个月时终止妊娠(mid-trimester pregnancy termination)不仅在心理上令人紧张还对母体有一定危险。

绒毛膜取样也要求熟练人员取得8-12周胎儿胎盘的少量生物活检样品，类似地，这也有诱导自发流产的危险。然而，能更早地诊断任何染色体异常使得CVS比羊膜穿刺术更有吸引力。

这两种方法需要熟练人员和可能诱导自发流产通常意味着只能对认为携带染色体异常胎儿的风险相当高的怀孕妇女实施这种产前遗传学评估。提供较简单方法的尝试包括获得从怀孕妇女的手臂静脉或子宫壁获得血液，提取通常从胎盘脱落的目前一致认为存在于母体血流中的胎儿细胞。这种非侵入性分离胎儿细胞消除了诱导自发流产的任何风险。

美国专利号5,503,981提供使怀孕哺乳动物的血液样品与有效量的绒毛膜合胞体滋养层和非绒毛膜细胞滋养层细胞的特异性抗体接触而分离血液样品中的滋养层细胞的方法。将该抗体结合的细胞与样品分开，利用分离的细胞获得遗传学和/或生物化学信息。

虽然从母体血流鉴定和分离胎儿细胞似乎提供了理想的非侵入性替代方法从而能获得用于产前遗传学检验的胎儿遗传材料，实际上，其主要的缺陷在于母体血流中的胎儿细胞极其稀少。现已测定母体血流中存在的滋养层细胞浓度非常低；因此，从母体血液中分离(细胞)的方法存在问题而且耗时。虽然已开发了几种改进的检测方法，包括聚合酶链式反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)，但将母体血液常规用于产前诊断依然存在主要问题；即不能合理地富集和/或分离与母体细胞相混合的非常少量胎儿细胞，从而不能获得真实可靠的诊断结果。这种分离的必需的，因为在许多诊断几乎不容许(存在)含母体DNA的细胞；例如分子诊断中，通常基本上是零容许。

因此，母体血液中胎儿细胞的极端稀少导致设计了许多专门技术以图从母体血液中富集和/或分离胎儿细胞组分或胎儿遗传材料。美国专利号5,432,054披露采用梯度离心分离胎儿细胞的富集方法。这种方法通常不够灵敏，从而不能有效分离可用于高度可靠遗传学检验(例如，基本上零容许)的胎儿细胞组分。

还采用美国专利号4,675,286披露的标记抗体方法尝试从母体血液样品中分离胎儿细胞，该方法采用流式细胞术将胎儿细胞与母体细胞组分分开。然而，流式细胞术分选的固有局限性也阻碍了这些方法更广泛地应用于该目的。这些流式细胞技术的主要局限性在于这些技术所用的抗体。虽然产生的这些抗体是细胞特异性的，但它们常与样品中存在的浓度非常高的其它不需要的细胞类型交叉反应。因此，虽然这些方法足以按胎儿细胞类型富集混合物，但它们常不能用于可靠、零容许的胎儿细胞分离。

美国专利号5,580,724披露了从母体血液样品中获得胎儿来源细胞的方法，其采用离心法首先分离单核的细胞(MNC)。除去血浆和培养基后，洗涤MNC层，在含5％二氧化碳的高湿度气氛中，在含有干细胞因子(SCF)、促红细胞生成素和I1-3及I1-16的的专门培养基中培育7天。通过抽吸回收不粘附的细胞，然后在有助于胎儿干细胞生长的条件下将细胞重新接种并培养14天。21天后，计数细胞，接种并检查。长时间的滞后和花费妨碍其采纳用于临床实践。

美国专利号6,221,596指导从包含混合细胞群的母体血液样品中分离稀少细胞类型，例如滋养层细胞的方法，该方法首先提供样品一部分的放大图像。形态学鉴定细胞群内的稀少细胞类型，利用显微操作仪回收鉴定的稀少细胞类型。该方法需要技术和专用设备，而且耗时。