[发明专利]通过dsRNA结合域与PTD/CPPS的融合物转导运输siRNA

说明书

相关申请的交叉引用

[0001]本申请根据35 U.S.C.§119要求2006年2月10日提交的美国临时申请序列号60/772,787和2006年2月21日提交的美国临时申请号60/775,638的优先权，其公开内容通过引用并入该申请。

关于联邦政府资助研究的声明

[0002]根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)第RO1CA96098号基金，美国政府在本申请中拥有一定的权利。

技术领域

[0003]本发明涉及向细胞进行核酸运输。更具体地，本发明涉及用融合到对阴离子电荷进行中和的核酸结合域的蛋白质转导域来向细胞运输带阴离子电荷的分子如siRNA。

背景技术

[0004]对作为一种选择性降解mRNA的细胞机制的发现允许靶向操作细胞培养物中的细胞表型靶向以及可能研发出定向疗法(Behlke，Mol.Ther.13，644-670，2006；Xie等人，Drug Discov.Today 11，67-73，2006)。

[0005]尽管siRNA具有很大的潜力用于细胞表型的操作，但由于其大小以及带有负(阴离子)电荷的性质，因而siRNA是不能进入细胞的大分子。实际上，siRNA超过Lipinski的“5s规则”的25倍，该规则被用于膜可扩散分子的细胞运输，通常这些分子的大小限制在小于500Da。因此，在缺少运输载体或转染剂的情况下，裸siRNA即使在毫摩尔浓度的条件下也不进入细胞(Barquinero等人，Gene Ther.11 Suppl 1，S3-9，2004)。重要关注集中使用对siRNA进行浓缩并在细胞膜穿孔的阳离子脂质，以解决siRNA的运输问题。尽管被广泛应用，但转染剂仍然不能够有效运输到许多细胞类型中，尤其是原代细胞以及造血细胞系(T细胞和B细胞，巨噬细胞)。此外，脂质转染剂常常导致不同程度的细胞毒性，其可从肿瘤细胞中的轻微水平到原代细胞中的高水平。

[0006]最近的细胞定向靶向法：抗体融合至DNA浓缩鱼精蛋白(Song等人，Nat.Biotechnol.23，709-717，2005)以及siRNA融合至受体靶向的RNA适体(McNamara等人，Nat.Biotechnol.24，1005-1015，2006)提供了将siRNA运输到所选择的细胞中的可能。尽管这两种方法很有前途，但它们不能够将siRNA运输到100％的表达受体的肿瘤细胞中，也不容易进行改变以适合其它的非受体表达细胞，并且只在几种细胞类型上经过测试。最近，通过包含胆固醇形成LDL粒子以及PEI缩合的方法而引入聚集体形成纳米粒子或者将siRNA封装在脂质体中以掩蔽负电荷的方法已经显示出能够在不同程度上成功地将siRNA运输到一些肿瘤细胞中(Scherr等人，Ann.Hematol.83，1-8，2004；Schiffelers等人，Nucleic AcidsRes.32，e149，2004；Song等人，2005；Soutschek等人，Nature 432，173-178，2004；Urban-Klein等人，Gene Ther.12，461-466，2005；Zhang等人，Genet.Vaccines Ther.3，5，2005)。因此，设计出通过快速、非毒性机制来解决针对～100％的所有细胞类型、原代以及致瘤细胞的siRNA大分子运输问题，对于在细胞培养物中RNAi扩增的潜能、靶向筛选以及治疗剂研制来讲显是重要的。

发明内容

[0007]本发明提供一种组合物，其含有核酸结合蛋白质，其与带阴离子电荷的核酸复合形成核酸结合蛋白质-核酸复合物；以及连接到该核酸结合蛋白质-核酸复合物的蛋白质转导域(PTD)。一方面，核酸结合蛋白质含有双链RNA结合域(DRBD)。另一方面，核酸是带有阴离子电荷的核酸。再一方面，核酸含有dsRNA。

[0008]本发明进一步提供一种含有融合多肽的组合物，该多肽含有：i)含有蛋白质转导部分(PTD)的第一结构域，该转导部分具有膜运输功能；以及ii)含有核酸结合蛋白质的第二结构域；b)核酸，其中该核酸带有阴离子电荷并且与核酸结合蛋白质相互作用，且其中PTD-核酸结合蛋白质-核酸的全部阴离子电荷相对于单独的核酸减少；以及c)药学上可接受的载体。