[发明专利]用于核酸作图和鉴定核酸的精细结构变化的方法以及用途

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求保护基于2006年1月4日申请的美国临时专 利申请美国序号60/756,417、2006年4月17日申请的美国临时专利 申请美国序号60/792,926和2006年6月15日申请的美国临时专利申 请美国序号60/814,378的优先权。前述临时申请的完整内容通过引用 结合到本文中。

发明领域

一般地讲，本发明涉及高通量分析核酸的精细结构变化的 方法。具体地说，本发明涉及产生连接核酸的标签对的新策略、载体 和载体组分，其中连接的核酸标签对的组成成员处于用户限定的分隔 距离，和/或为沿着靶核酸分子长度分界一个或多个不同限制性内切核 酸酶的邻近切割位点的核酸位置的标记。

发明背景

尽管最丰富且研究最深入的人类基因组变体类型是单核苷 酸多态性(SNP)，但日益清楚的是，含有拷贝数(插入、缺失和复制) 改变、倒位、易位和其它序列重排的所谓“精细结构变化”为人类基 因组和其它基因组的整体特征。这些类型的变化似乎以比最初设想高 得多的频率存在于一般人群中。建立的证据表明，结构变化可在每个 基因组中包含上百万的核苷酸异质性。理解精细结构变化在基因组进 化、与环境的相互作用、表型多样性和疾病或疾病易感性中的作用是 当前基因组研究中最活跃的研究领域之一。关于综述，参见Feuk等 (2006)，Redon等(2006)，Check(2005)，Cheng等(2005)和Bailey等 (2002)。[0004]与SNP分析相比，用于分析精细结构变化的有效高通 量方法还没有被充分开发。重要的第一步是阵列比较基因组杂交(阵列 CGH)技术(Pinkel等，1998；Pinkel等，美国专利第5,830,645号和第 6,159,685号)，该技术能够定量靶DNA和参比DNA之间的相对拷贝 数。阵列CGH允许以单个排列的细菌人工染色体(BAC)克隆水平的分 辨率可靠地检测DNA或基因组样品之间的脱氧核糖核酸(DNA)拷贝 数差异(Snijders等，2001；Albertson等，2000；Pinkel等，1998)。针对 cDNA(Heiskanen等，2000；Pollack等，1999)和高密度寡核苷酸阵列平 台(Bignell等，2004；Brennan等，2004；Huang等，2004；Lucito等，2003) 修改阵列CGH进一步扩展了该方法的分辨率和应用性。通过其应用， 阵列CGH已能够鉴定与肿瘤(Pinkel和Albertson，2005；Inazawa等， 2004；Albertson和Pinkel，2003；Pollack等，2002)和疾病发展(Gonzalez 等，2005)相关的基因拷贝数变化。

尽管对拷贝数测定有用，但阵列CGH不适合于解决其它 类型的基因组结构变化，最显著地，不适于倒位、易位和其它类型的 核酸重排。Tuzun等(2005)尝试用称为“fosmid配对末端作图”的方 法解决这些限制。该方法依靠fosmid包装的头部满装(head-full)机制， 产生具有相当均一的约40kb大小的测试者基因组插入片段的基因组 DNA文库。随机选择的约40kb文库插入片段的末端终止测序产生成 对的短序列标签，其中每个标签-对标记两个基因组位置，这两个基因 组位置沿着靶DNA长度间隔约40kb。然后用计算机比对标签-对和 参比基因组组装，在它们的预期方向或它们的约40kb间隔距离方面 的任何不一致性都应表明在靶和参比核酸之间跨越该区域存在至少 一个结构差异。作图位置间隔40kb以上的的标签-对表示相比于参比 在靶DNA上存在缺失；间隔低于40kb的作图位置表示在靶中有DNA 插入片段。已作图的标签对方向的不一致性表示潜在的DNA倒位或 其它复杂的染色体重排。标签-对分配给参比序列上的两个不同染色体 表示染色体易位。Tuzun等(2005)分析超过一百万个fosmid克隆，能 够在测试者和参比基因组组装之间鉴定出接近300个结构变化位置。