[发明专利]检测类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母以及生物测试方法，具体的说是涉及一种利用酵母双杂交技术获得的包含重组维甲酸X受体基因的双杂交酵母，以及利用该酵母来检测类/抗维甲酸化合物，特别是环境中的类/抗维甲酸化合物的生物测试方法。

背景技术

环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指人类在生产、生活过程中释放到环境中的某些有毒化学物质，它们与人体和动物体内的激素具有类似的化学结构，并能够产生类似激素的作用。它们进入体内，扰乱了激素的正常分泌，使人和动物的生理过程发生紊乱，导致生殖、免疫等功能发生障碍。环境中的内分泌干扰物的干扰效应包括：雌激素干扰效应、雄激素干扰效应、维甲酸干扰效应等。维甲酸(retinoic acid，RA)也称为视黄酸，是指天然或人工合成的维生素A的衍生物，具有重要生理活性，特别是对生物体的胚胎发育、器官形成、生殖等具有重要作用。已经发现持久性有毒有机污染物(POPs)的暴露与生物体内维甲酸平衡的破坏相关，尽管这类具有维甲酸干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和动物体内，可以与特定的维甲酸受体结合形成复合物，启动/抑制下游基因的表达，干扰内分泌系统的正常功能。90年代对维甲酸X受体作用机制的研究进一步发现了维甲酸X受体的共激活因子(coactor)，并建立了新的受体作用理论(参见，Hong，H.，Kohlit，K.，Trivedit，A.，Deborah，L.，Johnson，D.L.和Stallcup，M.R.，1996，Natl.Acad.Sci.USA.93：4948-4952)。该理论认为，维甲酸(或者环境中类/抗维甲酸物质)与相应维甲酸X受体的配体结合区(LBD)  结合后引起构象改变，进一步结合共激活因子，促进转录。

对环境中维甲酸干扰效应的研究刚刚起步，目前报道应用较多的为化学分析和生物测试方法。化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求。另外一种广泛采用的是利用重组维甲酸X受体酵母菌(Yeast Estrogen Screen，YES)进行测试，这种测试利用的是重组维甲酸X受体及受体共激活因子TIF2构建的双杂交酵母(参见，Nishikawa，J.I.，Mamiya，S.，2004，Environ.Sci.Technol.38：6271-6276)。目前，通常采用报道基因的方法指示外界干扰、如化合物暴露等对基因转录的影响。在双杂交酵母方法中，通常采用的LacZ基因是一种常用的编码β-半乳糖苷酶的报道基因，其产物β-半乳糖苷酶具有强的酶催化活性，能够与特定底物反应生成新的有色化合物，易于检测。因此，通过简单测定β-半乳糖苷酶的活性，就能够表征对基因转录的影响。Nishihara等报道的双杂交酵母方法采用的是Y190酵母菌株作为载体，随着技术的发展采用Y187(含有双拷贝数的编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因)酿酒酵母菌株作为载体，由于其高的β-半乳糖苷酶表达量，则更能提高整个方法的灵敏度与准确性，减少假阳性或假阴性结果的产生。

发明内容

本发明的目的在于构建一种用于检测样品中类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母，在此基础上建立一种检测类/抗维甲酸化合物的生物测试方法。该检测方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少。

本发明是通过下述方案实现的：

本发明的一个方面提供了一种用于检测环境样品中的类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母，其中，该酵母中含有pGBT9-RXR酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，并且所述pGBT9-RXR酵母表达质粒包含维甲酸X的受体基因，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ IDNo.2所示序列的维甲酸X受体共激活因子基因片段。

优选地，所述维甲酸X受体基因为鼠维甲酸X受体基因或具有如SEQID No.1所示序列的鼠维甲酸X受体基因片段。

所述的双杂交酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RXR-GRIP1，其保藏编号为：CGMCC No.2305。该酵母已于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。