[发明专利]检测类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

权利要求书

1.一种用于检测样品中类/抗维甲酸化合物和/或天然维甲酸化合物的双杂交酵母，其特征在于，该酵母中含有pGBT9-RXR酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，并且所述pGBT9-RXR酵母表达质粒包含维甲酸X的受体基因，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含序列为SEQ ID No.2的维甲酸X受体共激活因子基因片段，所用酵母为酿酒酵母Y187。

2.根据权利要求1所述的双杂交酵母，其特征在于，所述维甲酸X受体基因为鼠维甲酸X受体基因或序列为SEQ ID No.1的鼠维甲酸X受体基因片段。

3.根据权利要求1或2所述的双杂交酵母，其特征在于，该双杂交酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RXR-GRIP1，其保藏编号为：CGMCC No.2305。

4.根据权利要求1或2所述的双杂交酵母，其特征在于，所述类维甲酸化合物选自有机锡类类维甲酸化合物、酚类类维甲酸化合物、邻苯二甲酸酯类类维甲酸化合物和有机氯农药类类维甲酸化合物中的一种或几种，并且所述的抗维甲酸化合物选自酚类抗维甲酸化合物、邻苯二甲酸酯类抗维甲酸化合物和有机氯农药类抗维甲酸化合物中的一种或几种。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的双杂交酵母的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)纯化包含维甲酸X受体基因的pGBT9-RXR酵母表达质粒；

(2)纯化包含维甲酸X受体共激活因子基因的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒；

(3)构建双杂交酵母，用所述的pGBT9-RXR质粒和所述的pGAD424-GRIP1质粒转化进入酵母细胞中，形成双杂交酵母。

6.根据权利要5所述的方法，其特征在于所述的形成双杂交酵母之后还筛选所述的双杂交酵母。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的筛选双杂交酵母是采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的菌落转移滤膜分析是采用添加维甲酸的X-gal缓冲液的菌落转移滤膜分析。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述维甲酸为9-顺维甲酸。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述X-gal缓冲液为20mg·mL^-1的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述营养缺陷型筛选中采用的培养基为不添加亮氨酸和色氨酸的SD培养基，该培养基由20mg/L腺嘌呤半硫酸盐、20mg/L盐酸精氨酸、20mg/L一水合盐酸组氨酸、30mg/L异亮氨酸、30mg/L盐酸赖氨酸、20mg/L甲硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200mg/L苏氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150mg/L缬氨酸和6.7g/L无氨基酸酵母氮源组成。

12.权利要求1-4中任一项所述的双杂交酵母用于检测类维甲酸化合物的生物测试方法，该方法包括如下步骤：

(1)首先将双杂交酵母细胞分别接种于已知系列浓度维甲酸培养液，形成菌液，培养2-4小时；

(2)培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应30-60分钟，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

(3)根据所述的系列浓度维甲酸相对于它所对应的β-半乳糖苷酶活性的参数绘制β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线；

(4)将所述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照所述的β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线计算出待测样品中类维甲酸化合物的含量。

13.根据权利要求12所述的生物测试方法，其特征在于，所述的待测样品为环境样品的有机溶剂提取液，其中的类维甲酸浓度为10^-9～10^-7mol/L。