[发明专利]用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法，具体的说是涉及一种利用酵母双杂交技术获得的包含重组雌激素受体基因的双杂交酵母，以及利用该酵母来检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法。

背景技术

环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指人类在生产、生活过程中释放到环境中的某些有毒化学物质，它们与人体和动物体内的激素具有类似的化学结构，并能够产生类似激素的作用。它们进入体内，扰乱了激素的正常分泌，使人和动物的生理过程发生紊乱，导致生殖、免疫等功能发生障碍。环境中的内分泌干扰物的干扰效应包括：雌激素干扰效应、雄激素干扰效应、甲状腺激素干扰效应等，特别是雌激素干扰效应能够对生物及人类生殖系统造成严重影响。尽管具有雌激素干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和动物体内，可以与特定的雌激素受体结合形成复合物，该复合物进一步结合到细胞核中的雌激素反应元件(ERE)，启动/抑制下游基因的表达，干扰内分泌系统的正常功能。90年代对雌激素受体作用机制的研究进一步发现了雌激素受体的共激活因子(coactor)，并建立了新的受体作用理论(参见，Hong，H.，Kohlit，K.，Trivedit，A.，Deborah，L.，Johnson，D.L.和Stallcup，M.R.，1996，Natl.Acad.Sci.USA.93：4948-4952)。该理论认为，雌激素(或者环境中类雌激素物质)与相应雌激素受体的配体结合区(LBD)结合后引起构象改变，进一步结合共激活因子，促进转录。

对环境中雌激素干扰效应进行研究，通常采用化学分析和生物测试技术。化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求。另外一种广泛采用的是利用重组雌激素受体酵母菌(Yeast Estrogen Screen，YES)进行测试，这种测试利用的是重组雌激素受体及受体反应元件构建的单杂交酵母。单杂交酵母方法并未考虑到雌激素受体共激活因子的作用。而且目前国内所用的重组酵母菌株几乎都来自国外实验室，基本上没有国内实验室进行菌株的构建工作。因此该重组菌种需要长期冷冻保存，一旦菌种发生回复突变，性状就很难回复。利用双杂交酵母技术将雌激素受体基因或基因片段以及共激活因子基因片段同时导入酵母细胞则可以克服单杂交酵母的缺点，并与新的受体作用理论相一致。已经有证据表明基于新的受体作用理论建立的核受体双杂交酵母系统更加接近哺乳动物内分泌系统的真实作用情况(参见，Nishihara，T.，Nishikawa，J.，2000，Journal of Health Science.46(4)：282-298)。而且，通过实验室直接构建酵母菌株，能够有效的控制回复突变的影响，测定环境化合物的雌激素干扰效应时能够得到更好的质量控制。

目前，通常采用报道基因的方法指示外界干扰、如化合物暴露等对基因转录的影响。其中，LacZ就是一种常用的编码β-半乳糖苷酶的报道基因，其产物β-半乳糖苷酶具有强的酶催化活性，能够与特定底物反应生成新的有色化合物，易于检测。因此，通过简单测定β-半乳糖苷酶的活性，就能够表征对基因转录的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术使用重组雌激素受体基因单杂交酵母对类雌激素污染物进行测定时由于缺乏受体共激活因子，因而不能模拟真核细胞真实情况，容易产生假阴性或是假阳性结果的缺陷，从而构建能够同时表达雌激素受体和受体共激活因子的双杂交酵母，并在此基础上建立一种经济高效的评价环境样品对雌激素受体干扰活性的生物测试方法。该检测方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，灵敏度高，能够反映环境样品中雌激素受体的诱导效应，并且通过标准曲线计算得到样品中类雌激素污染物的毒性当量值。

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母，该酵母包含pGBKT7-ER酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表达质粒包含雌激素受体基因，所述pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受体共激活因子基因片段。具体而言，上述雌激素受体基因优选人雌激素受体基因或具有如SEQ ID No.1所示序列的人雌激素受体基因片段。所述类雌激素化合物选自天然雌激素化合物、酚类及经过代谢转换能够形成酚类的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药中的一种或几种。