[发明专利]用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

权利要求书

1.一种用于检测环境样品中类雌激素化合物或天然雌激素化合物的双杂交酵母，其特征在于，该酵母中含有pGBKT7-ER酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表达质粒包含序列为SEQ ID No.1所示的人雌激素受体基因片段，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含序列为SEQ ID No.2所示的雌激素受体共激活因子基因片段，所用酵母为酿酒酵母Y187。

2.根据权利要求1所述的双杂交酵母，其特征在于，所述类雌激素化合物选自酚类类雌激素化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的双杂交酵母，其特征在于，所述双杂交酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ER-GRIP1，其保藏编号为CGMCCNo.2307。

4.一种根据权利要求1至3中任一项所述的双杂交酵母的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建包含所述雌激素受体基因的pGBKT7-ER酵母表达质粒；

(2)纯化包含所述雌激素受体共激活因子基因的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒；

(3)采用上述两种质粒构建双杂交酵母ER-GRIP1；

(4)筛选双杂交酵母ER-GRIP1。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括设计雌激素受体配体结合域ER LBD的PCR引物，其中在上、下游引物的5′端分别引入EcoR I和BamH I单一酶切位点，并且上游引物P1：5′-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3′；下游引物P2：5′-TAACGCGGATCC TCAGACTGTGGCAGG-3′。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中同时用pGBKT7-ER质粒和pGAD424-GRIP1质粒转化进入酿酒酵母细胞Y187(Saccharomyces cerevisiae)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选所述双杂交酵母。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中采用添加雌激素的X-gal缓冲液的菌落转移滤膜分析。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述雌激素为17β-雌二醇。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述X-gal缓冲液为20mg·mL^-1 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述营养缺陷型筛选中采用的培养基为不添加色氨酸和亮氨酸的SD培养基，该培养基由20mg·L^-1腺嘌呤半硫酸盐，20mg·L^-1盐酸精氨酸，20mg·L^-1一水合盐酸组氨酸，30mg·L^-1异亮氨酸，30mg·L^-1盐酸赖氨酸，20mg·L^-1甲硫氨酸，50mg·L^-1苯丙氨酸，200mg·L^-1苏氨酸，30mg·L^-1酪氨酸，20mg·L^-1尿嘧啶，150mg·L^-1缬氨酸，6.7g·L^-1无氨基酸酵母氮源组成。

12.一种检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：将权利要求1至4中任一项所述的双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，根据终止反应后检测到的上清液在420nm处的吸光度值来计算类雌激素化合物的浓度。