[发明专利]利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法。

(二)背景技术

感音性神经性耳聋(sensorineural hearing loss)在临床上很常见，最新报道达数十亿人，占人口总数的10％左右。在欧美就超过9亿人。主要是因为内耳毛细胞数量有限，只有大约1500个；易受衰老、噪声、耳毒性药物、外伤、感染、肿瘤、遗传性疾病、免疫性疾病等体内外因素的影响而损伤或破坏；且哺乳动物耳蜗毛细胞破坏后再生能力有限，常可引起永久性的听力下降，治疗非常困难。随着干细胞研究的深入，通过干细胞移植或再生补偿毛细胞的损失，是迄今研究最活跃的领域之一。

干细胞按其细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞通常是指源自囊胚内细胞团的细胞，在一定条件下可向内、中、外三个胚层的组织和细胞分化，同时具有无限扩增的能力。成体干细胞是指存在于成年动物许多组织和器官，具有修复和再生能力的细胞。目前发现有成体干细胞的组织类型有10多种，如心脏、骨髓、脑、肝、视网膜等。

胚胎干细胞在体内外均可以分化为内耳毛细胞。Li等将胚胎干细胞进行体外诱导分化培养，发现培养至第八天，细胞表达神经前体细胞特异性蛋白nestin和毛细胞前体细胞特异性蛋白Pax2；继续培养10～14天，这些细胞表达内耳成熟毛细胞的标志物。将体外培养的毛细胞前体细胞注入到胚胎的听泡中，几天后细胞迁移到内耳毛细胞区，并分化为成熟的毛细胞。

神经干细胞是成体干细胞的一种，可以在体内外分化为毛细胞。Kojima等最先报道神经干细胞在体外培养，可以诱导分化为毛细胞。Ito等将神经干细胞经蜗壁、园窗或卵园窗注入耳蜗发现神经干细胞迁移至柯替氏器毛细胞的表面，并具有内毛或外毛细胞的形态。

胚胎干细胞和神经干细胞在体内外诱导分化为内耳毛细胞的成功，为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供了坚实的基础。但是，胚胎干细胞和神经干细胞取材困难，受到医学伦理学和法律的制约，很难在临床推广应用。

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)是骨髓中除了造血干细胞以外的另一类成体干细胞，这类细胞具有高度自我更新和多向分化的潜能。在不同条件下骨髓间充质干细胞可以定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、心肌细胞、肝细胞。MSC是自体组织，来源广泛，分离培养容易，免疫源性弱，是用于体内相关疾病的细胞替代治疗的理想靶细胞。

2000年Li等将MSC直接注入大脑中动脉闭塞的大鼠纹状体内，28d后观察到MSC不仅在脑内成活，而且向缺血区迁移，部分细胞表达神经细胞的特异性蛋白。2001年Lu等将MSC从静脉植入大鼠脑外伤模型内，发现MSC植入能够使脑外伤后的各种神经功能障碍得到改善。2000年Brazelton和Mezey以不同的方式证实，外源性的MSC注入小鼠脑内可以转化为神经元。2003年张杰等对Wistar大鼠骨髓间充质干细胞视网膜下移植的研究发现，MSC能够在视网膜下存活，并能与原视网膜结构相融合。可以认为MSC是神经移植的理想供体。尤其是骨髓间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞、神经元和神经胶质细胞的实验引起了我们的兴趣。Kopen等首先报道小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后，MSCs迁徙经过前脑、小脑，在纹状体、海马中分化为成熟的神经胶质细胞，在脑干的网状结构中分化为神经元。Woodbury等以β2巯基乙醇、二甲基亚砜和叔丁基羟基茴香醚诱导骨髓MSCs，结果约50％～80％分化为神经元。骨髓间充质干细胞能诱导分化为神经细胞，而神经干细胞又能在一定条件下分化为毛细胞，那么骨髓间充质细胞向内耳毛细胞的诱导分化就很值得研究。

但目前仍需解决以下问题：(1)再生的骨髓MSC是否有成熟细胞的功能；(2)再生的骨髓MSC是否有效地与周围组织细胞结构相融合并加入到神经环路中；(3)如何提高骨髓MSC在体内的成活率和诱导定向分化能力；(4)骨髓MSC移植的安全性等。通过国内外文献检索，尚未有关于骨髓间充质干细胞移植在耳蜗损伤中应用的相关研究报道。目前尚未见体外培养骨髓MSC定向诱导分化为耳蜗感觉上皮细胞的报道，其关键是要找到合适的诱导因子。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法。

本发明采用的技术方案是：