[发明专利]利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法

权利要求书

1.一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法，所述方法是将分离提纯的骨髓间充质干细胞经传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞转入诱导分化培养基，诱导培养7～20天，获得内耳毛细胞前体；所述的诱导分化培养基为添加有生长因子的基础培养基，所述生长因子主要包括表皮生长因子和胰岛素样生长因子-1，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子、全反式维甲酸的组合，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基，BDNF 10～30ng/mL基础培养基，ZTRA0.5～2×10^-8mol/L基础培养基。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法按如下步骤进行：(1)将分离提纯的骨髓间充质干细胞在在MSC培养基中传代培养，使骨髓间充质干细胞传代，获得稳定的传代的骨髓间充质干细胞；(2)经消毒处理的盖玻片经多聚赖氨酸包被后作为用于细胞爬片的备用盖玻片；(3)待步骤(1)的骨髓间充质干细胞传代传至第3代时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，离心后用MSC培养液重悬，得到细胞悬液，调整细胞悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为1×10⁵～2×10⁵/ml，将细胞悬液滴加于所述备用盖玻片上，覆盖上表面，盖玻片周边滴加基础培养基覆盖，在37℃、5％CO₂条件下培养，细胞即在盖破片中生长，为第4代细胞；(4)待细胞生长覆备用盖玻片表面50％～60％时，倾去MSC培养液，加入诱导分化培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养，培养7～20天，获得内耳毛细胞前体。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基础培养基为含2％胎牛血清和1％N2辅剂的低糖DMEM液。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将所述骨髓间充质干细胞培养传代至第4代后，再添加生长因子进行诱导培养。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述传代培养在低糖DMEM液与胎牛血清液体积比250∶44.117的混合溶液中进行。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子和胰岛素样生长因子-1的组合，添加量为：EGF 20ng/mL基础培养基，IGF-150ng/mL基础培养基。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子、全反式维甲酸的组合，添加量为：EGF 20ng/mL基础培养基，IGF-150ng/mL基础培养基，BDNF 20ng/mL基础培养基，ZTRA 1×10^-8mol/L基础培养基。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述骨髓间充质干细胞分离提纯方法如下：取4～5周龄SD大鼠，脱颈处死，消毒后取出股骨，将股骨剪开，用低糖DMEM液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心，取沉淀，用15％干细胞培养液重悬，37℃、5％CO₂条件下于培养瓶中培养10～16h，倾去未贴壁细胞，加入0.01MPBS去除贴壁不牢固细胞，再用0.01M PBS洗涤后，加入15％干细胞培养液，37℃、5％CO₂条件下培养获得纯化的骨髓间充质干细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述15％干细胞培养液为低糖DMEM液与胎牛血清液体积比250∶44.117的混合液。