[发明专利]一种阿魏酸酯酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体地，涉及一种通过测定反应体系的OD值检测阿魏酸酯酶活性的方法。

背景技术

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主要反应为：多糖～阿魏酸酯+H₂O＝阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。

阿魏酸酯酶在造纸、食品、制药及饲料工业有很广泛的应用空间。近年来，阿魏酸酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。秸秆和饲草干物质中约30％～80％为细胞壁成分，然而，反刍动物对这些细胞壁的消化利用率不超过50％。因此，细胞壁成为秸秆和饲草利用的瓶颈因素。

阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测认为是消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。

多种天然和合成底物被用来检测阿魏酸酯酶的活性，如脱淀粉小麦麸、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、阿魏酰基寡糖等。根据底物利用数据及一级序列同一性，阿魏酸酯酶已被分为4个亚类，type～A、B、C、D。这4类阿魏酸酯酶均可水解最简单的底物阿魏酸甲酯，释放出的阿魏酸通常经由HPLC、GC或分光光度计进行检测。

但是HPLC和GC所需仪器设备昂贵，操作复杂，花费较高，应用分光光度计进行检测相对成本较低，但这三种方法对样品的需要量都较大，步骤繁琐，费时费力。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速简便、可用于大量样品检测的阿魏酸酯酶活性检测方法。

为了实现本发明的目的，本发明的一种阿魏酸酯酶活性检测方法，其步骤包括：将待测酶液与阿魏酸甲酯溶液混合，进行反应，检测OD值，计算酶活性。

所述的待测酶液的制备步骤包括：在96孔板上每孔加入50～100μL适当稀释9～1600倍的待测酶液，35～65℃预热10～30分钟。优选地为39℃预热15分钟。

所述的阿魏酸甲酯溶液的制备步骤包括：称取适量104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH4.5～7)稀释至50～200μM，35～65℃预热10～30分钟。优选的为稀释至100μM，pH为6.0，预热为15分钟。所述的反应温度为35～65℃，反应时间依据样品活性而定，一般为10～30分钟。

所述的OD值是在340nm下用酶标仪检测。

所述的一种阿魏酸酯酶活性检测方法，具体包括如下步骤：

(1)称取104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH4.5～7)稀释至50～200μM，35～65℃预热10～30分钟，得到阿魏酸甲酯溶液；

(2)在96孔板上每孔加入适当稀释6～1600倍的待测酶液，35～65℃预热10～30分钟，得待测酶液；

(3)在步骤(2)的待测酶液中，在48个孔中加入步骤(1)的阿魏酸甲酯溶液，35～65℃反应10～30分钟，使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；用100mM MOPS缓冲液(pH6.0)替代阿魏酸甲酯溶液作为酶空白加入其余的48个孔中；

(4)通过如下公式计算阿魏酸酯酶的活性：

其中OD_反应起始：反应起始反应体系的OD值；

OD_反应终止：反应终止反应体系的OD值；

OD_{酶空白起始}：不加待测酶反应起始反应体系的OD值；

OD_{酶空白终止}：不加待测酶反应终止反应体系的OD值；

V_体系：反应体系的总体积；

l：光程厚度(cm)

ε_{阿魏酸甲酯}：阿魏酸甲酯的消光系数；

ε_阿魏酸：阿魏酸的消光系数；

V_样品：待测酶液的体积。

其中，待测酶液与阿魏酸甲酯溶液的体积比为50～100∶100～200；优选地为100∶200。其中，步骤(1)、(2)和(3)中预热温度及反应温度应一致。

本发明的检测方法可用于阿魏酸酯酶酶制剂活性的批量检测，在饲料业、造纸业、制药业、香料生产中具有较高的实际应用价值。酶活定义：一定温度下，每分钟由阿魏酸甲酯释放出1uM阿魏酸所需酶量为1U，U/mL。