[发明专利]WANG策略固相合成肽技术

说明书

技术领域

本项目涉及一些活性肽的固相合成方法，特别适用于经济、实用的大批量制备原料药的生产工艺。

背景技术

半个世纪以来，由Merrifield教授发明的固相肽合成法极大地促进了医药科学的发展。迄今为止，Boc/Bzl/强酸解树脂方式及Fmoc/tBut/弱酸解树脂方式是众多固相肽合成技术中最广泛被应用的两种保护策略。它们各自的匹配方式如图1所示。

上述经典匹配策略中，Boc化学采用的是酸梯度选择性脱保护方式。其中每步缩合后用弱酸(如TFA)只脱除α-氨基上的临时保护Boc基；待全部缩合完成后，用强酸(如HF或TFMSA)脱除全部侧保护基及固载树脂。Fmoc化学采用的是正交选择性脱保护方式。其中每步缩合后用有机碱(如20％哌啶/DMF或5％DBU/DMF)脱除α-氨基上的Fmoc基；待全部缩合完成后，用弱酸(如TFA)同时脱除全部侧保护基及弱酸解型树脂。从这两种匹配策略的最后一步释放游离肽的反应中可见，它们共同之处是将脱除侧保护及裂解载体树脂反应同时发生。然而，由此得到的产物肽必然与大量的酸解试剂、清除剂(Scavengers)及侧保护基与清除剂键合的副产物混在一起。这是上述两种经典方式合成肽不可避免的结果，得到的粗产物纯度较差，增加了进一步纯化的难度。

发明内容

鉴于现行的Boc化学及Fmoc化学在固相合成肽中经典匹配策略上存在的不足，本发明提供一种全部缩合完成后的脱除侧保护反应与裂解树脂反应分步进行的新策略。其目的是将固相合成特有的“过滤/淋洗/纯化”功能进一步延伸至脱除全部侧保护基阶段。在此阶段，本发明合成的肽分子依然键合在固相树脂上，因此可以用相应的溶剂淋洗肽树脂，充分除去脱保护试剂及游离下来的侧保护基等杂质。随后对无保护基的赤裸肽-树脂进行氨解反应，切除树脂同时释放出基本不含杂质的产物肽。因此本发明提供的固相肽合成方式又可简称为WANG(withoutacid-cleavage/nice gain)策略肽合成法。与固相肽合成中的经典策略相比，WANG策略合成的粗产物纯度明显优于前者(图2)。

在采用WANG策略合成肽中，本发明使用的Merrifield树脂是唯一的固相载体。不带侧保护基的Boc-氨基酸为：Boc-Ala，Boc-Arg(.HCl)，Boc-Gly，Boc-Ile，Boc-Leu，Boc-Phe，Boc-Pro，Boc-Ser，Boc-Thr，Boc-Tyr，Boc-Trp，Boc-Val，Boc-Asn，Boc-Gln，Boc-βAla，Boc-Abu(γ-氨基丁酸)及Boc-Aca(ω-氨基己酸)。Fmoc-氨基酸的侧保护情况为Fmoc-(Cys(Trt)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asp(OtBu)及Fmoc-Glu(OtBu)。缩合剂组份分别为DCC(二环己基碳二亚胺)与HOBt(N-羟基苯并三唑)的等摩尔混合物，HBTU(O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲翁六氟磷酸盐)与HOBt及NMM(N-甲基吗啉)的等摩尔混合物，或TBTU(O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲翁四氟硼酸盐)的等摩尔混合物。其它试剂与溶剂的缩写形式为：H₂NMe(甲胺)、H₂NEt(乙胺)、H₂NBu(正丁胺)、TEA(三乙胺)、H₂NBn(苄胺)、HNMe₂(二甲胺)、TFA(三氟乙酸)、TESi(三乙基硅)、DMF(二甲基甲酰胺)、Py(吡啶)、DCM(二氯甲烷)、THF(四氢呋喃)、HOAc(乙酸)。脱除Boc试剂组合物：3N HCl/HOAc或饱和HCl/EtOAc或50％TFA/DCM。脱除Fmoc试剂组合物：20％哌啶/DMF。切除树脂(氨解)组合物：H₂NR/H₂O-THF(1:1)。

本发明涉及的化合物合成中，改变了Boc保护方式的肽合成必需经强酸[如HF或HBr/HOAc或TFMSA(三氟甲磺酸)裂解切除树脂，或Fmoc保护方式的合成必需使用昂贵的树脂(如Wang树脂、Rink树脂等)而且用TFA裂解切除树脂的两种互为独立的传统方式。采用了交叉匹配的合成策略，以最廉价的氯甲基树脂为固相载体、兼用Boc及Fmoc两种保护方式的氨基酸为原料。其中正确使用Boc-氨基酸及Fmoc-氨基酸是确保本发明涉及的合成技术成功与否的关键。对此，本发明确定了如下合理使用保护方式的原则：

①Boc-氨基酸的缩合应先于Fmoc-氨基酸。