[发明专利]一种白腐真菌及其选育方法和应用

权利要求书

1、一种白腐真菌(Trametes Versicolor)YS-L613，其特征在于：其由以下方法诱变选育而制得，以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、⁶⁰CO、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。

2、一种如权利要求1所述的白腐真菌(Trametes Versicolor)YS-L613的诱变选育方法，其特征在于：以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、⁶⁰CO、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。

3、根据权利要求2所述的白腐真菌(Trametes Versicolor)YS-L613的诱变选育方法，其特征在于：具体方法包括以下步骤：

(1)出发菌种，以白腐真菌YS菌株为出发菌种，4℃保藏于CPDA斜面；

(2)培养基①斜面培养基(CPDA)为每20％土豆汁1000mL中含葡萄糖15—25g、MgSO₄·7H₂O 1—2g、KH₂PO₄ 2—4g、VB1 1—3mg、琼脂粉13—16g；②摇瓶液体发酵培养基：每1000mL发酵培养基中含有葡萄糖15—25g、天冬酰胺2—3g、MgSO₄·7H₂O 0.1—1g、FeSO₄·7H₂O 8—12mg、MnSO₄·4H₂O 0.1—1mg、ZnSO₄·7H₂O 0.1—1mg、CuSO₄·5H₂O 1—3mg、NaHPO₄·H₂O 90—110mg、KH₂PO₄ 0.1—1g、CaCl₂ 8—12mg、VB1 48—52mg、Kraft　Lignin(碱溶木素)0.1—1g；③液体种子培养基：葡萄糖1—3％、MgSO₄·7H₂O 0.1—1％、KH₂PO₄ 0.1—0.5％、VB1 2×10^-4％、土豆汁20％、其余为水；发酵培养基(g/L)：玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgSO₄·7H₂O 0.1—1g、FeSO₄·7H₂O 8—12mg、MnSO₄·4H₂O 0.5—1mg、ZnSO₄·7H₂O 0.5—1mg、CuSO₄·5H₂O 1—3mg、NaHPO₄·H₂O 90—110mg、KH₂PO₄ 0.5—1g、CaCl₂ 8—12mg、VB1 50mg、KraftLignin(碱溶木素)0.5—1g，pH8.5；

(3)种瓶制备：取保藏的真菌斜面进行活化培养，挑取适量菌丝块于250mL的三角瓶中(内装50mL液体培养基)，于30℃，150r/min，振荡培养3d；发酵培养：将种瓶培养物匀浆后接入发酵瓶，于30℃，150r/min，培养5天；

(4)菌悬液的制备：将培养4—5d斜面菌种，有无菌的生理盐水洗下菌丝体，经玻璃珠打散，制成含菌体10⁶-10⁸的悬液；①紫外线诱变：取10ml菌悬浮液于直径为9cm的平皿中，磁力搅拌，于20W紫外线灯15—20cm处，照射1—10min；②亚硝基胍(NTG)诱变：用pH　6.0、0.2mol/L磷酸盐缓冲液制成的菌悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/ml NTG浓度，30℃温度，诱变20min，稀释法终止反应；③⁶⁰Co　γ-射线辐射诱变：取10ml菌悬浮液于无菌试管中，分别以8万、10万、伦琴进行60Coγ-射线辐射；④离子束注入诱变处理：取纯种斜面加入10mL无菌水洗脱菌丝体，并稀释成一定浓度的菌丝体悬液，取0.1mL菌悬液于无菌空平皿中涂均匀，用无菌风吹干；然后放入离子注入机的靶室进行离子注入，注入完毕后，用无菌水洗脱，稀释涂平皿，等单单菌落生成后，转接于斜面培养基上；⑤微波诱变：吸取制得菌悬浮液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的菌液为10ml，调整微波炉(格兰仕)功率为700W，脉冲频率为2450Hz，辐照处理20s、40s、60s、80s、100s，其中每辐照10s，要冷却10s，然后适当稀释涂分离平板；

(5)突变株分离：上述各诱变处理的菌悬液，取0.1ml涂布与分离培养基上30℃，培养4—5天(紫外线诱变平板避光培养)，挑取单菌落，培养3—4天备用；

(6)筛选，对诱变入后的菌株进行筛选时，突变株酶活力高于对照菌株5％的突变株为正突变，而低于5％的菌株称为负突变，在±5％之间作为未突变菌株。