[发明专利]单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫学，尤其涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法。

背景技术

随着分子免疫学的发展，根据淋巴细胞膜表面分化抗原群(cluster ofdifferentiation，CD)的不同，可将T、B、NK淋巴细胞分成若干亚群，临床实验室通过抗分化抗原抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD20、抗CD16、抗CD56等的单克隆抗体(McAb)，对外周血淋巴细胞进行检验，依据其阳性率判定总T细胞、T辅助性细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)亚群、B淋巴细胞、NK细胞等的分布和变化，从而判断人体的免疫功能，达到预防保健和疾病的诊断、治疗、预后的目的。

目前，淋巴细胞亚群常用的检验方法有流式细胞仪法、免疫荧光法、AP-AAP桥联酶免疫法和SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)花环法。其中SPA花环法又分红细胞花环法和菌花环法，而红细胞花环法又分直接法和间接法。

SPA红细胞花环法的间接法因为应用单克隆抗体(McAb)，又叫单克隆抗体SPA红细胞花环法间接法，简称McAb-A-E间接法。该法在《全国临床检验操作规程》(中华人民共和国卫生部医政司编，第二版，东南大学出版社，1997：381～384和第一版1991：320～322)中仅有McAb-A-E法原理以及直接法的摘要性论述，但无详尽操作方法，实际工作中按“冻干抗体致敏红细胞花环试剂使用说明书”规定的方法进行具体操作：(1)将冻干二抗(羊或兔抗小鼠IgG)致敏红细胞花环试剂中加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液(简称无钙、镁Hank’S液)或磷酸盐缓冲液(PBS)溶解；(2)将一抗——冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体加入1.0mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液或PBS溶解；(3)按常规法(分离细胞以2000～2500rpm离心20～30min，用无钙、镁Hank’S液洗涤2次，每次转速为1000～1500rpm，离心5～10min)用淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞，最后用含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液配成500万/mL；(4)将试管呈20度角斜放，于37℃孵育45min，将细胞悬液取出置另一试管中，离心去上清并恢复原量备用；(5)根据待检样品数取一定量溶解后的一抗，用pH值为7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液稀释；根据待检样品数取一定量二抗(羊或兔抗小鼠IgG)致敏红细胞花环试剂悬液，离心去上清，用含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，恢复至原量；(6)将待测淋巴细胞悬液与一抗等量混合(各25～50μL)，在4℃作用30min，然后用pH值为7.0～7.4的无钙、镁Hank’S液洗3次；(7)一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞悬液等量混合(各25～50μL)，室温(22～25℃)下放置10min，500rpm离心10min，室温下继续放置1小时，并在4℃放置2小时或过夜；(8)轻轻悬浮后加入25μL梅-格氏染液(May～Gruenwaid)室温染色10min后，离心去上清，再加50μL的姬姆萨染液(Glemsa液)染色30min(或单用Glemsa液染色)，当天或第二天看结果均可；(9)结果检查及判定：用高倍镜检查，淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者即除掉不计数统计，计数100～200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率。

虽然McAb-A-E间接法所采用的冻干抗体致敏红细胞花环试剂本身具有特异性强、敏感、稳定性好、有效期长、使用方便、仅需普通光学显微镜即可进行检验的特点，且实验结果可保存两周左右，十几年来被临床实验室和相关研究单位广泛应用，但是McAb-A-E间接法作为一种临床检验方法却由于存在检验步骤多、所需标本量相对较多、周期长、易造成被测细胞损伤和丢失、个别重要步骤无量化控制指标、非特异花环鉴别困难而影响计数结果等缺陷，无法适应临床上快速、准确的要求，使很多实验室，特别是临床实验室接受困难，限制了该方法的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种检验过程简化、检验周期短、能够进行量化控制、满足临床检验要求的单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法。

为解决上述问题，本发明所述的一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法，包括下述步骤：

(1)配制一抗保存液；

(2)配制二抗致敏红细胞保存液；