[发明专利]单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法

权利要求书

1.单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法，包括下述步骤：

(1)配制一抗保存液；

(2)配制二抗致敏红细胞保存液；

(3)分离外周血淋巴细胞后用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400～600万/mL淋巴细胞悬液；

(4)将一抗保存液用10倍的pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释，形成一抗应用液。

(5)取二抗致敏红细胞保存液，以300～500rpm转速离心6～10min后去上清，用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取二抗致敏红细胞保存液等量的二抗致敏红细胞应用液；

(6)将淋巴细胞悬液以1∶1的体积比与一抗应用液混合并在4℃下作用30min；经pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤弃上清后，按与淋巴细胞悬液1∶1的体积比加入pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液形成一抗致敏淋巴细胞悬液；

(7)将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合，在18～28℃下放置10min；以300～500rpm转速离心5min后在4℃静置15～45min；

(8)用20或25μL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液8～15次；取混合悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计数：淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法，其特征在于：所述步骤(1)中的一抗保存液是通过将冻干一抗加入1.0mL pH值为7.0～7.4无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻干一抗为冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体中的任意一种。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法，其特征在于：所述步骤(2)中的二抗致敏红细胞保存液是通过将冻干二抗致敏红细胞花环试剂加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻干二抗为羊或兔抗小鼠IgG。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体SPA红细胞花环法检验淋巴细胞亚群的间接法，其特征在于：所述步骤(3)中的分离外周血淋巴细胞是指将采用肝素或乙二胺四乙酸抗凝剂抽取的静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀后加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液与稀释血液的体积比为1∶1～3，在18～28℃温度下，以800～1200rpm的转速离心15～20min；再取出单个核细胞，并对单个核细胞用pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤，每次以300～500rpm的转速离心6～10min后弃上清制得。