[发明专利]一种黄瓜高频率植株再生方法无效
申请号: | 200710193073.7 | 申请日: | 2007-12-06 |
公开(公告)号: | CN101449658A | 公开(公告)日: | 2009-06-10 |
发明(设计)人: | 李建吾;胡建斌;秦智伟;周秀艳 | 申请(专利权)人: | 河南农业大学 |
主分类号: | A01H4/00 | 分类号: | A01H4/00;C12N5/04;A01G31/00 |
代理公司: | 郑州中原专利事务所有限公司 | 代理人: | 赵 磊 |
地址: | 450002*** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 黄瓜 频率 植株 再生 方法 | ||
技术领域
本发明属于植物生物技术领域,尤其涉及一种黄瓜高频率植株再生方法。
背景技术
黄瓜组织培养技术的研究起始于上个世纪七十年代(Cutts RHA.Plant Sci Lett,1975,4:189-193),但真正取得有用结果的还是在近几年(陈继峰,上海农业学报,2007,23:114-118)。用于黄瓜组织培养的外植体的种类很多,如子叶、真叶、下胚轴、叶柄、茎尖、根、合子胚等,大多研究都能得到组织培养小苗。尽管黄瓜组织培养的成功经验很多,但在某些方面还存在着不少问题。首先,黄瓜组织培养具有很强的基因型特异性,植株再生频率低且不稳定,技术的重复性差(候爱菊,朱延明,杨爱馥,等.园艺学报,2003,30:101-103);其次,由于黄瓜再生植株一般要经过愈伤组织的形成、不定芽分化、茎芽伸长和生根几个过程,因而已有的黄瓜植株再生体系,操作技术繁琐,植株再生周期长(Kuijpers AM,Bouman H,Klerk GJ.Plant Cell Tiss Org Cult,1996,1:81-83);第三,多数研究者倾向通过体细胞胚途径获得黄瓜再生植株,但体细胞胚转化成正常植株的频率低,且无性系变异大,不利于培育遗传稳定、一致的再生植株(Lou H,Kako S.HortiScience,29:906-909)。这些不利因素在一定程度上限制了黄瓜生物工程育种的进展。随着生物工程技术的迅速发展,植株快速克隆技术和遗传转化技术将在黄瓜生物技术育种中得到广泛应用,这就需要建立一种操作简便、周期短、技术稳定的高效植株再生体系,但目前的黄瓜离体再生技术体系,并不能完全满足当前黄瓜生物技术研究的需要。因此,建立一种频率高、周期短、技术稳定,且适用于多个基因型的离体植株再生体系,是当前黄瓜组织培养研究的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄瓜高频率植株再生的方法,以满足黄瓜生物工程育种研究的需要。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:一种黄瓜高频率植株再生方法,由下述步骤组成:
a、选取黄瓜饱满、无病虫的种子,用0.1%氯化汞表面消毒,并接种到MS培养基上培养成苗,选取粗壮的幼苗切除一片子叶和生长点,制备Flamingo-bill外植体;所述的Flamingo-bill外植体为一种多组织成分的特殊外植体,它由子 叶、下胚轴和根三部分组成;
b、将Flamingo-bill外植体接种到芽诱导培养基上,使其诱导出不定芽;外植体接种方式是将其根部斜插入培养基中,芽诱导培养基是MS培养基附加0.5~1.0mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)、0.5~1.0mg/L AgNO3和30g/L Suc(蔗糖);
c、将外植体连同不定芽转入增值培养基,使不定芽的数量扩大3倍,同时不定芽得以伸长;芽增值培养基为附加1.0~1.5mg/L 6-BA、0.5~1.0mg/L AgNO3和30g/L Suc的MS培养基;
d、当芽长到1~2cm时从基部切离外植体,接种到生根培养基,使其生根长成完整植株;生根培养基为1/2MS培养基附加20g/L Suc;
e、将具有完整根系的植株移栽到营养土中,使其在自然条件下生长。
在步骤a中,0.1%氯化汞浸泡种子的时间为8~10min,消毒后用无菌水冲洗4~5次,并用无菌滤纸吸干种子表面水分。
在步骤a中,用于Flamingo-bill外植体制备的幼苗苗龄为2~3d,苗高3~4cm,下胚轴直径3~5mm。
在步骤a中,采用无菌手术刀片由上至下将一片子叶和生长点切除,切口深度为下胚轴直径的1/2,切口斜面长度为0.4~0.5cm。
MS培养基琼脂用量为0.7%,培养基灭菌方式为在121℃下灭菌18min,培养基的pH值为5.8。
所述培养条件为温度25±1℃,光照强度为50μmol·m-2·s-1,光周期为12~14h/d。
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